雌激素通过激活AKT通路产生的细胞因子增强子宫内膜癌细胞增殖能力

背景与目的：目前认为子宫内膜癌的发生可能与无拮抗的雌激素长期作用有关,但雌激素如何调节细胞增殖的作用机制尚不清楚。AKT信号转导通路是细胞生存和增殖的一个重要调节信号。本研究探讨在子宫内膜癌细胞HEC-1A中,雌二醇能否通过激活AKT通路产生细胞因子,以及其对细胞增殖能力的影响。方法：蛋白质印迹法(Western blot)技术检测雌二醇作用HEC-1A细胞后AKT活化情况,以及AKT抑制剂、ER抑制剂对AKT活化的影响。荧光定量PCR及ELISA技术检测雌二醇(E2组)作用于HEC-1A细胞30 min后;或雌激素受体抑制剂(ER组)、AKT抑制剂(AKT组)分别预处理细胞1 h后再加入雌二醇作用30 min后,细胞内血管内皮生长因子受体(VEGF)、bFGF、IL-8基因mRNA表达及细胞培养上清液中蛋白表达。细胞集落形成实验、流式细胞仪检测细胞周期的变化,CFSE法检测细胞增殖能力。结果：E₂组的AKT活化比值较对照组显著升高(P=0.006 2),ER组和AKT组的AKT活性比值较E2组显著降低(P=0.006 0和P=0.006 4),但不能完全抑制雌二醇作用。E₂组的VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表达均明显高于对照组(P均<0.01);在ER组及AKT组中VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表达均明显低于E2组(P均<0.05);雌二醇作用HEC-1A细胞后,细胞增殖数明显增多,细胞周期加快(P均<0.01)。结论：在HEC-1A细胞,雌二醇可能通过激活AKT信号通路产生VEGF、bFGF、IL-8因子,从而增强肿瘤细胞的增殖能力。     

雌激素诱导子宫内膜癌细胞血管因子生成的作用

目的探讨雌激素诱导子宫内膜癌细胞HEC-1A血管因子生成的机制,阐述雌激素在子宫内膜癌发生中的作用。方法以雌激素（E2组）作用于HEC-1A细胞30min,雌激素受体抑制剂（ER组）、AKT抑制剂（AKT组）、NF-κB抑制剂（NF-κB组）分别预处理HEC-1A细胞1h,各加入雌激素作用30min后;采用qRT-PCR检测各组细胞内血管因子mRNA表达,Westernblot检测血管因子蛋白的表达情况。结果 E2组的血管因子mRNA及蛋白的表达均明显高于对照组（P〈0.05）;ER组、AKT组及NF-κB组的血管因子mRNA和蛋白的表达均明显低于E2组（P〈0.05）。结论雌激素在子宫内膜癌HEC-1A细胞中起到信号传导的作用,可调节血管生成因子的表达,参与子宫内膜癌发生、发展的过程。     

全反式维甲酸和三氧化二砷抑制子宫内膜癌细胞生长及其与NDRG1基因的关系

目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷（As2O3）对人子宫内膜癌HEC-2B细胞体外生长的抑制作用及其与分化相关基因1（NDRG1）的关系。方法 采用MTT法比较不同浓度（1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6和1×10-5mol／L）ATRA和（1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μmol／L）As2O3对子宫内膜癌HEC-2B细胞的增殖抑制作用,Western blotting检测HEC-2B细胞中NDRG1蛋白的表达情况。结果 镜下观察,经ATRA和As2O3作用48h后的子宫内膜癌HEC-2B细胞呈现凋亡的特征性改变。1×10-7～1×10-5mol／L 的ATRA和1.0～16.0μmol／L的As2O3能够抑制子宫内膜癌HEC-2B细胞的生长,呈剂量和时间依赖性。ATRA和As2O3能够从蛋白水平调节NDRG1的表达,其表达随药物浓度的增加逐渐下调。结论 ATRA和As2O3能够抑制子宫内膜癌HEC-2B细胞的生长,该抑制作用可能与NDRG1蛋白下调有关。     

JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响

目的：研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响。方法：AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下（CoCl2200μmol/L）48h后Westernblot法测定A549细胞中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化（分组为对照组、AG49050μmol/L、AG490100μmol/L、CoCl2、CoCl2＋AG49050μmol/L和CoCl2＋AG490100μmol/L组）。IL-6（3.85nmol/L）处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化（分组为对照组,IL-6组）。结果：JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显。缺氧条件下（CoCl2200μmol/L）能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。AG490也能够下调CoCl2诱导的HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著。IL-6能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。结论：在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达。JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用。     

SU11274抑制人子宫内膜癌细胞增殖的分子机制

目的:探索HGF/c-met传导通路抑制剂SU11274抑制子宫内膜癌细胞增殖的分子机制。方法:使用不同浓度SU11274（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L）作用ishikawa 和HEC-1B 两种细胞株1小时后，加入40 ng/ml的HGF，继续培养48小时，然后使用RT-PCR检测c-met、Survivin、XIAP水平以及Western blot检测细胞中Survivin、XIAP蛋白表达水平。结果:ishikawa细胞c-met低表达，而HEC-1B细胞c-met明显高表达，HEC-1B细胞中c-met mRNA表达量为ishikawa中的2.5倍。SU11274可以使HEC-1B、ishikawa细胞的Survivin、XIAP蛋白表达下调，呈现剂量依赖性，并且在HEC-1B细胞中，该下调作用明显强于ishikawa细胞（P<0.05）。结论:SU11274可以通过下调HGF/c-met传导通路中Survivin、XIAP的表达来抑制人子宫内膜癌细胞增殖。     

阿帕替尼调控WWOX对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的:探讨阿帕替尼（Apatinib）是否通过包含氧化还原酶的WW结构域（WWOX）影响子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭。方法:噻唑蓝（MTT）比色法检测4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L Apatinib作用于子宫内膜癌细胞HEC-1 24 h、48 h、72 h后的细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、WWOX蛋白水平,Transwell小室法检测迁移细胞数、侵袭细胞数。在HEC-1中转染pcDNA3.1-WWOX,或转染si-WWOX并用16 μmol/L Apatinib进行处理,采用上述方法评估细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况。结果:Apatinib明显降低HEC-1细胞活性（P＜0.05）,呈剂量、时间依赖性;Apatinib显著增加HEC-1细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达量（P＜0.05）,呈剂量依赖性;Apatinib明显降低Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量（P＜0.05）,呈剂量依赖性;16 μmol/L Apatinib显著减少HEC-1细胞的迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2蛋白表达量（P＜0.05）,明显提高E-cadherin、WWOX蛋白表达量（P＜0.05）。过表达WWOX明显降低HEC-1细胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达量、细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数（P＜0.05）,提高p21、Bax、E-cadherin、WWOX蛋白表达量及细胞凋亡率（P＜0.05）。抑制WWOX表达逆转了Apatinib对HEC-1细胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达量、细胞活性、迁移、侵袭的抑制作用,以及逆转了其对p21、Bax、E-cadherin、WWOX蛋白表达量、细胞凋亡的促进作用。结论:阿帕替尼通过调控WWOX表达,抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导细胞凋亡。     

雌二醇对宫颈癌细胞基质金属蛋白酶2和9表达的影响

[目的]探讨雌二醇对宫颈癌细胞株Hela和Siha基质金属蛋白酶（MMP）2和9mRNA转录水平的影响。[方法]采用RT—PCR检测雌二醇（1×10^4mol／L）干预72h后两株细胞MMPs表达的变化。[结果]Hela细胞株表达MMP-9，但不表达MMP-2，而Siha细胞相反。雌二醇干预后，Hela细胞MMP-9 mRNA表达明显高于对照组（P=0．004），Siha细胞MMP-2 mRNA的表达与对照组的无显著性差异（P=0．409）。[结论]MMPs在宫颈鳞癌和腺癌中可能表达不同的亚型．1×10^-8mol／L的雌二醇能够促进Hela细胞MMP-9 mRNA的转录。     

JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

目的:研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响.方法:AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下(CoCl2 200μmol/L)48h后Western blot法测定A549细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组、AG490 50μmol/L、AG490 100μmol/L、CoCl2、CoCl2+AG49050μmol/L和CoCl2+AG490 100μmol/L组).IL-6 (3.85nmol/L)处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组,IL-6组).结果:JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显.缺氧条件下(CoCl2200μmol/L)能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.AG490也能够下调CoCl2诱导的HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著.IL-6能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.结论:在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达.JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用.     

柴胡皂苷d通过AKT/mTOR信号通路调控胶质瘤C6细胞自噬

目的 探讨柴胡皂苷d在胶质瘤C6细胞自噬中的作用及其机制。方法 分别以终浓度为0 μmol/L（Control组）、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L的柴胡皂苷d作用胶质瘤C6细胞后,用CCK⁃8检测细胞增殖能力,后续分别采用克隆形成实验、划痕实验检测柴胡皂苷d（8 μmol/L）对胶质瘤C6细胞增殖能力和细胞迁移能力的影响,Western blot和qRT⁃PCR检测胶质瘤C6细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和AKT/mTOR信号通路相关蛋白及基因的表达情况。结果 与Control组比较,各浓度柴胡皂苷d均能抑制胶质瘤C6细胞增殖且增殖抑制率随着药物浓度的升高而升高（均P<0.01）。8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后,与Control组比较,胶质瘤C6细胞的克隆形成数目显著减少［（479.33±30.66）个 vs （258.66±73.35）个,P<0.01］,细胞迁移率显著降低［（70.83±4.29）% vs （19.47±1.71）%,P<0.001］,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的蛋白及mRNA表达水平均显著升高（均P<0.01）,而AKT和mTOR信号蛋白及mRNA表达水平均降低（均P<0.01）。结论 柴胡皂苷d可能通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导胶质瘤C6细胞发生自噬并抑制其增殖与迁移。     

二甲双胍对LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的影响

目的 研究二甲双胍对LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖与细胞周期的影响。方法 以不同浓度的二甲双胍作用于LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞（LKB组）与缺失LKB1基因表达的HEC-1A细胞（CON组）。用流式细胞术仪检测各组HEC-1A细胞的细胞周期;RT-PCR法和Western blot技术检测各组HEC-1A细胞的LKB1、mTOR基因与蛋白的表达;以平板克隆法与细胞迁移实验检测各组细胞的细胞增殖水平。结果 与缺失LKB1基因表达的HEC-1A细胞比较,LKB1基因过表达的HEC-1A细胞随着二甲双胍浓度的升高明显降低细胞克隆形成率、细胞迁移率、S 期细胞比例及mTOR基因与蛋白的表达,而增加G₀ /G₁期细胞比例及LKB1基因与蛋白的表达,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 二甲双胍抑制LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的生长和侵袭,其机制可能为介导LKB1/mTOR信号传导通路而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。     

9-顺式维甲酸抑制甲状腺鳞癌细胞SW579增殖的作用机制

  目的  观察9-顺式维甲酸(9-cis-retinoic acid, 9-cisRA)对甲状腺鳞癌细胞株SW579细胞RARβ、p21、CDK4、CyclinDl表达的影响, 进而探讨9-cisRA的抗癌作用机制。  方法  分别以终浓度为1×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L 9-cisRA作用SW579细胞, 各组细胞均在培养24 h后加药, 继续培养48 h。用RT-PCR方法检测SW579细胞RARβ、p21、CDK4、CyclinD1的mRNA表达; 用Western Blot检测SW579细胞RARβ、p21、CDK4、CvclinD1的蛋白表达。  结果  9-cisRA作用后, RT-PCR检测结果表明, 经不同浓度9-cisRA处理的细胞RARB、p21的mRNA表达水平均显著上调; CDK4的mRNA表达水平无明显变化; CyclinD1的表达水平明显下调; Western Blot检测结果表明经不同浓度9-cisRA处理的细胞RARβ、p21蛋白表达水平均显著上调; CDK4蛋白表达水平无明显变化; CyclinD1蛋白表达水平明显下调。  结论  9-cisRA在一定浓度范围内可能通过上调RARβ、p21的表达进而下调细胞周期蛋白CvclinD1的表达, 从而抑制细胞增殖。      

子宫颈癌患者人乳头状瘤病毒感染型别分布情况分析

 【摘要】目的 探讨子宫颈癌患者人乳头状瘤病毒（HPV）的感染情况及型别分布,分析其与子宫颈癌的相关性。方法 选取2011年1月至12月就诊的子宫颈癌患者67例,采用凯普HPV分型诊断系统进行HPV-DNA分型检测,分析子宫颈癌患者HPV感染状况。结果 67例子宫颈癌患者中HPV感染阳性率为68.66%（46/67）。其中感染HPV16型20例,18型11例,52型1例,53型2例,66型3例,11型1例,81型1例;16+18型3例,52+53型1例,59+11型1例;11+18+53型1例,16+45+66型1例。结论 高危型HPV持续感染是子宫颈癌发生、发展的首要条件,与子宫颈癌密切相关。高危型HPV16、18型是最主要的感染亚型。     

(−)-Epigallocatechin-3-gallate inhibits human papillomavirus (HPV)-16 oncoprotein-induced angiogenesis in non-small cell lung cancer cells by targeting HIF-1α

Purpose

To investigate the effects of (?)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on human papillomavirus (HPV)-16 oncoprotein-induced angiogenesis in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and the underlying mechanisms.

Methods

NSCLC cells (A549 and NCI-H460) transfected with EGFP plasmids containing HPV-16 E6 or E7 oncogene were treated with different concentrations of EGCG for 16 h. The effects of EGCG on angiogenesis in vitro and in vivo were observed. The expression of HIF-1α, p-Akt, and p-ERK1/2 proteins in NSCLC cells was analyzed by Western blot. The levels of HIF-1α mRNA in NSCLC cells were detected by real-time RT-PCR. The concentration of VEGF and IL-8 in the conditioned media was determined by ELISA. HIF-1α, VEGF, and CD31 expression in A549 xenografted tumors of nude mice was analyzed by immunohistochemistry.

Results

HPV-16 E6 and E7 oncoproteins HIF-1α-dependently promoted angiogenesis in vitro and in vivo, which was inhibited by EGCG. Mechanistically, EGCG inhibited HPV-16 oncoprotein-induced HIF-1α protein expression but had no effect on HIF-1α mRNA expression in NSCLC cells. Additionally, 50 and 100 μmol/L of EGCG significantly reduced the secretion of VEGF and IL-8 proteins induced by HPV-16 E7 oncoprotein in NSCLC A549 cells. Meanwhile, HPV-16 E6 and E7 oncoproteins HIF-1α-dependently enhanced Akt activation in A549 cells, which was suppressed by EGCG. Furthermore, EGCG inhibited HPV-16 oncoprotein-induced HIF-1α and HIF-1α-dependent VEGF and CD31 expression in A549 xenografted tumors.

Conclusions

EGCG inhibited HPV-16 oncoprotein-induced angiogenesis conferred by NSCLC through the inhibition of HIF-1α protein expression and HIF-1α-dependent expression of VEGF, IL-8, and CD31 as well as activation of Akt, suggesting that HIF-1α may be a potential target of EGCG against HPV-related NSCLC angiogenesis.     

雌激素对ER阴性的子宫内膜腺癌细胞JEC增殖的作用

 目的 研究不同浓度的雌激素（17-βE₂）对雌激素受体（ER）阴性的子宫内膜腺癌细胞系JEC增殖和细胞周期的影响。 方法 采用细胞计数法、四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）和流式细胞术（FCM）的方法,观察人子宫内膜腺癌细胞系JEC在加入17-βE₂后的增殖活性和细胞周期时相变化;同时用免疫组化及图像分析,检测JEC细胞在加入17-β E₂前后细胞周期调控蛋白cyclin A表达的变化。 结果 （1）1×10^-7和1×10^-6mol/L的雌激素作用JEC细胞4天后, 细胞计数均明显高于对照组,而其余浓度E₂无明显作用。不同浓度E₂ 作用JEC 24h、48h后,MTT法测OD值和对照组相比无明显差异;1×10^-6mol/L的E₂作用JEC 72h后,其OD值较对照组显著增高;（2）17-β E_2（1×10^-6mol/L）作用JEC细胞72h后使S期及G₂/M期的细胞比例增加,G₀/G₁期细胞比例减少。但作用48h后细胞周期时相分布无明显变化;（3）17-β E₂作用JEC后可使细胞内cyclin A蛋白表达明显增加。 结论 一定浓度的雌激素能促进JEC细胞体外增殖,且具有剂量和时间效应性。研究提示,这种调控作用可能与cyclin A表达的变化有关。     

Highly metastatic human prostate cancer growing within the prostate of athymic mice overexpresses vascular endothelial growth factor.

Angiogenesis is essential for tumor progression and metastasis. It is mediated by the release of angiogenic factors by the tumor or host. We analyzed the expression of angiogenic factors by the prostate cancer cell line LNCaP and two derived variants, in vitro and in vivo, to determine whether metastatic cell lines express higher levels of these factors. The production of three angiogenic factors, vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and interleukin 8 (IL-8), by LNCaP and its variants, LNCaP-LN3 (highly metastatic) and LNCaP-Pro5 (slightly metastatic), was measured by ELISA. VEGF, bFGF, and IL-8 mRNA expression was determined in vitro by Northern blot analysis. VEGF mRNA expression was determined in vivo by in situ hybridization. VEGF and flk-1 protein expression and microvessel density of LNCaP cell tumors were quantified by immunohistochemistry. In vitro, VEGF production by LNCaP-LN3 (3.15+/-0.04 pg/ml/10(3) cells) was significantly higher than those of both LNCaP (2.38+/-0.34 pg/ml/10(3) cells) and LNCaP-Pro5 (1.67+/-0.37 pg/ml/10(3) cells; P = 0.049 and 0.001, respectively). None of the three cell lines produced detectable levels of bFGF or IL-8 in vitro. In vivo, LNCaP-LN3 tumors exhibited higher levels of VEGF mRNA and protein (152.2+/-28.5 and 200.5+/-28.3) and of flk-1 protein (156.5+/-20.6) and had higher microvessel density (16.4+/-4.2) than either LNCaP tumors (89+/-17.5, 173.3+/-23.0, 124.6+/-21.6, and 12.4+/-3.5, respectively) or LNCaP-Pro5 tumors (63+/-14.7, 141.2+/-38.1, 126.1+/-20, and 5.8+/-2.2, respectively). In conclusion, metastatic human prostate cancer cells exhibited enhanced VEGF production and tumor vascularity compared with prostate cancer cells of lower metastatic potential. Thus, VEGF may play an important role in prostate cancer metastasis.     

唑来膦酸对LM8骨肉瘤细胞VEGF表达和分泌的影响

目的研究唑来膦酸对骨肉瘤LM8细胞株VEGF表达和分泌的影响。方法不同浓度的唑来膦酸处理LM8细胞,用RT-PCR法检测LM8细胞VEGFmRNA转录水平;免疫组化和ELISA法分别检测VEGF蛋白表达和分泌的水平。结果LM8细胞中均有VEGFmRNA转录,VEGF蛋白的表达和分泌;与对照组相比,唑来膦酸组(25μmol/L,50μmol/L)作用LM8细胞24h下调了VEGFmRNA转录,VEGF蛋白的表达和分泌,且对照组和各浓度组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。结论唑来膦酸可抑制骨肉瘤LM8细胞VEGF表达和分泌。