恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

目的　在大肠埃希菌 (E .coli)中尝试非融合蛋白技术可溶性表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶 (GDH) ,以获得具有相对完整空间表位的重组非融合GDH。　方法　将恶性疟原虫GDH基因克隆到pET-23 (a)表达载体中 ,转化E .coli BL21菌株 ,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,菌体反复冻融后 ,通过十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析表达产物的存在形式 ,可溶性表达产物经Source-Q及Source-S层析纯化并用SDS PAGE分析纯度。通过蛋白质印迹试验鉴定表达和纯化产物的免疫学活性。　结果　可溶性重组GDH分子占宿主蛋白 15 %左右 ,相对分子质量为 5 2 0 0 0。经过阴离子和阳离子交换层析纯化后 ,GDH纯度达 90 %以上。该蛋白质具有良好的抗原性。　结论　通过E .coli表达系统和柱层析分离技术可获得高纯度、具有相对完整空间表位的重组GDH分子。     

两种纯化幽门螺旋杆菌VacA-HpaA融合蛋白包涵体方法的比较

目的比较Ni^2＋-NTA树脂和切胶纯化重组VacA-HpaA融合蛋白的纯化效果,探讨纯化蛋白包涵体的简易方法。方法克隆并表达重组pQE30-vacA-hpaA-DH5α工程菌,获得重组VacA-HpaA融合蛋白的包涵体,分别进行Ni^2＋-NTA树脂和切胶纯化,获得可溶性重组蛋白,Western blot鉴定其抗原性;用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗VacA、HpaA和VacA-HpaA的IgG水平,鉴定其免疫原性。结果两种方法均能纯化重组VacA-HpaA融合蛋白包涵体,得到可溶性的重组蛋白,Ni^2＋-NTA树脂纯化法获得的可溶性重组蛋白的纯度为95.8%,得率为63.5%;切胶纯化法获得可溶性重组蛋白的纯度为93.3%,得率为75.2%。Western blot鉴定纯化蛋白均具有良好的抗原性。ELISA法检测显示小鼠血清均能与重组蛋白VacA、HpaA和VacA-HpaA发生反应,两组IgG水平比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,均具有良好的免疫原性。结论切胶纯化重组VacA-HpaA融合蛋白包涵体是一种简单、经济的可行方法,有利于重组蛋白包涵体的纯化。     

结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG（简称rKatG）蛋白，为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法重组质粒pET23b—KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21（DE3）plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后，优化表达条件，用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白，对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定。结果成功构建了重组质粒pET、23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达，经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95．6％，过氧化氢酶试验阳性。结论构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白，经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白。     

肿瘤坏死因子家族的B细胞激活因子免疫抑制分子的表达及免疫原性分析

目的制备异源性T辅助细胞表位修饰的人可溶性肿瘤坏死因子家族的B细胞激活因子（BAFF）突变体，并对其免疫抑制功能进行分析。方法经原核表达和Ni-NTA层析纯化制备异源性T辅助细胞表位修饰的人可溶性BAFF突变体；用所制备的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中抗人BAFF抗体的滴度；四甲基偶氮唑蓝（MTTl）实验检测免疫小鼠血清抑制重组sBAFF和天然sBAFF功能的情况。结果重组蛋白在大肠杆菌中均获得了高效表达；经Ni-NTA层析纯化后，目的蛋白的纯度均达90％以上；用重组蛋白免疫小鼠均可诱导产生高滴度抗人可溶性BAFF抗体：免疫小鼠血清可抑制重组sBAFF和天然sBAFF刺激淋巴细胞增殖的功能。结论成功制备了可诱导产生高滴度特异性抗体的BAFF免疫抑制分子，为进一步探讨其治疗作用奠定了基础。     

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法，为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA，用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插人到表达载体pMAL-c2X中，用重组质粒转化大肠杆菌(E．coil TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料，制备层析柱，将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％；纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E．coli TB1中能够高效表达；用多糖树脂作为填充料，进行亲和层析的方法，具有良好的纯化效果。     

鼠伤寒沙门菌AvrA蛋白的原核表达及纯化

目的克隆,表达和纯化沙门菌AvrA蛋白,为AvrA蛋白的结构和功能研究奠定基础。方法采用生物信息学方法对AvrA蛋白的性质进行预测。使用PCR的方法从沙门菌基因组上获得AvrA36-277基因,并克隆到原核表达载体pGl01上;使用大肠埃希菌BL21(DE3)菌株进行目的蛋白的表达,表达产物分别经镍离子亲和柱、阴离子交换柱以及凝胶层析柱层析纯化。结果成功获得重组质粒AvrA36-277/pGl01,转化BL21后经IPTG诱导获得分子质量单位约为27ku的重组AvrA36-277蛋白。该蛋白以可溶形式表达,层析纯化后蛋白浓度达5mg/ml,蛋白纯度95%。结论使用大肠原核表达系统可稳定表达沙门菌的AvrA36-277蛋白,该蛋白可溶性良好,获得蛋白纯度较高,可用于蛋白底物的筛选、晶体生长及三维结构解析。     

重组人IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性形式表达、纯化及体外对T细胞增殖的影响

目的 为重组人白细胞介素-21(rhIL-21) 的生物学活性和功能研究奠定基础.方法 构建重组表达质粒pGEX4T-2/IL-21,通过降低培养温度等优化条件于大肠杆菌中表达出可溶性形式的rhIL-21融合蛋白,纯化后以不同质量浓度作用于T细胞,观察其对T细胞增殖的影响.结果 大肠杆菌表达出可溶性形式的rhIL-21融合蛋白,纯化纯度达95%;纯化后的rhIL-21蛋白作用后T细胞增殖增加,且随rhIL-21蛋白质量浓度的增加,T细胞增殖率升高.结论 大肠杆菌中获得rhIL-21的可溶性表达形式,纯化后的蛋白对T细胞增殖有促进作用;此为rhIL-21的生物活性及功能研究奠定了基础.     

GII.P16-GII.2型诺如病毒VLPs的纯化研究北大核心CSCD

目的诺如病毒(Norovirus)是一种重要的人畜共患病病毒,可感染人、猪、牛、犬等多种动物,引起诺如病毒病,每年给全球造成巨大的经济损伤。本研究基于AKTA纯化系统探索诺如病毒VLPs的纯化工艺。方法将诺如病毒重组杆状病毒接种到SF9细胞中培养,通过Western blot、间接免疫荧光试验以及SDS-PAGE进行鉴定,对鉴定正确的细胞培养产物采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,并对层析柱的选择、层析缓冲液的pH值、洗脱液NaCI浓度等进行优化。基于优化后的参数或条件通过AKTA纯化系统纯化诺如病毒VLPs,分析纯化效果。结果经Western blot、间接免疫荧光、以及SDS-PAGE等鉴定,诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,优化的纯化参数或条件为:阴离子纯化柱,层析缓冲液pH值为6.0,洗脱液NaCI浓度为0.2 mol/L。结论诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。优化的AKTA纯化系统可用于诺如病毒VLPs的纯化。     

SARS-CoVSpike蛋白受体结合区的表达及纯化

目的获得稳定表达SARS冠状病毒spike蛋白受体结合区的果蝇细胞系,表达spike蛋白受体结合区。方法设计引物扩增spike蛋白受体结合区318-513片段,构建重组表达载体S318-pMT/Bip/V5-his,与pCoBlast质粒共转染果蝇S2细胞,经Blasticidin筛选得到的稳定重组细胞系,用硫酸铜诱导表达,Western-Blot检测表达产物。富集的表达产物用镍柱和RESOURCES阳离子交换树脂纯化,SDS-PAGE和Western-Blot检测纯化产物。结果重组spike蛋白受体结合区可在果蝇S2细胞中分泌表达,且具有特异免疫反应性;经镍柱和RESOURCES纯化可得到纯度达90%以上的重组蛋白。结论克隆并在真核生物中分泌表达出具免疫反应原性的spike蛋白受体结合区,镍柱和RESOURCES两步纯化可得到高纯度蛋白。     

人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化

用含有载脂蛋白EcDNA的PET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），使之高效表达载脂蛋白E-thioredoxin融合蛋白，利用融合蛋白上的一段组氨酸序列，用镍离子亲合层析柱进行分离纯化。由于在载脂蛋白E和thioredoxin之间存在凝血酶的识别位点，用凝血酶消化后，经SephacrylS-300凝胶过滤得到人重组载脂蛋白E。用此方法可以从1L大肠杆菌培养液中纯化20-30mg高纯度的各种载脂蛋白E异构体和非自然存原突变体。方法简便，产量高，纯度达95%以上。