党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白（actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin 基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90%以上。结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆铁皮石斛Dendrobium officinale磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）基因,并对其在F型和H型铁皮石斛中的表达进行分析,为研究铁皮石斛pepc基因的结构、功能提供依据。方法 基于GenBank上已知的pepc基因的同源序列设计引物,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛pepc基因全长。采用荧光定量PCR方法研究pepc基因在2种铁皮石斛中的表达。结果 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,登录号为JF423930,该基因全长为3 560 bp,其中cds序列为2 895 bp,与兰科植物的同源性为80%左右,与其他科属植物的同源性达到70%以上,编码964个氨基酸。pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。结论 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,且F型铁皮石斛pepc基因的表达量高于H型。     

怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析

目的 对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT）cDNA全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据。方法 根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达。结果 RghKAT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框（ORF）,编码464个氨基酸;同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84%、82%、82%、79%、73%;RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88%、88%、86%、87%、78%;各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKAT mRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达最强,而在幼苗期叶中表达量最低。结论 成功克隆了RghKAT cDNA全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量最高。     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果 刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异（P＜0.05）。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论 首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS）基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础。方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA。结果 获得罗汉果FPPS（SgFPPS）基因的全长cDNA序列共1 354个核苷酸,包含一个1 026核苷酸的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×10⁴。NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1%。SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域。进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系。结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础。     

葫芦科植物通用DNA条形码的筛选

目的 评价几个热点DNA条形码候选序列对葫芦科植物的鉴别能力。方法 使用ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列的通用引物对葫芦科植物进行PCR扩增和测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率、种内和种间的变异、barcoding gap,并采取相似性探索BLAST 1和最近距离Nearest Distance 方法评价不同序列的鉴别能力。结果 ITS2序列对葫芦科33个属、90个物种、182个样本进行分析,其鉴定成功率较高,在属水平为100.0%,在物种水平为88.5%;psbA-trnH序列对201个样本进行分析,其鉴定成功率在属水平为93.0%,在物种水平为73.1%,但其可以补充部分ITS2不能分析的物种区域。结论 ITS2和psbA-trnH是适合葫芦科植物鉴别的一个较好的DNA条形码序列组合。     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶（spermidine synthase,SPDS）基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法 采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响。结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列。RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量（P＜0.05）,最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍。结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础。     

半夏及近缘种叶绿体非编码区序列分析

目的 通过测定半夏及近缘种的DNA叶绿体的非编码区序列,为半夏的分子鉴别和遗传多样性研究提供依据。方法 在我国半夏主要分布区收集到43份半夏及滴水珠和虎掌半夏2个近缘种,采用PCR法克隆叶片基因组DNA中psbK-psbI和atpF-atpH两段序列,借助生物信息学软件进行比对分析。结果 半夏atpF-atpH序列长为337～342 bp,较为保守,仅含变异位点7个,其中信息位点1个,遗传距离为0～0.024。半夏psbK-psbI序列长为432～435 bp,变异位点37个,其中信息位点17个,遗传距离为0～0.069。聚类分析结果均显示出与表型以及地理居群的不一致。结论 psbK-psbI序列较atpF-atpH有更好的鉴别能力,在半夏种内具有较丰富的变异位点。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

人参多向耐药性转运蛋白基因保守区序列的克隆及分析

目的 对人参多向耐药性（PDR）转运蛋白基因进行克隆及序列分析。方法 利用其他植物PDR基因的保守区域设计简并引物,以人参根总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增人参PDR基因片段并连接至pGEM-T Easy载体上,阳性克隆经PCR检测后测序。结果 得到一段长693 bp的基因序列,序列分析表明,该片段编码231个氨基酸,与植物PDR基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在76%和80%以上。分析表明该序列属于PDR转运蛋白的核苷酸结合域,具有PDR转运蛋白的C端Walker A、ABC标签模体和C端walker B 3个保守功能域。结论 首次从人参中克隆出PDR转运蛋白基因,为研究人参次生代谢产物的转运和积累机制奠定了基础。     

吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA克隆及序列分析

目的 克隆吴茱萸Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列。方法 根据已获得的吴茱萸Mn/Fe-SOD基因核心片段序列设计4条特异性引物,采用RACE和巢式PCR方法克隆获得吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA。结果 吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA序列共1 048 bp,包含一个687 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,共编码228个氨基酸。结论 首次从吴茱萸中克隆得到了Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列,为研究该基因在吴茱萸体内超量表达以提高植物抗逆性研究奠定基础。     

半夏凝集素基因的克隆与氨基酸序列初步分析

目的 克隆半夏凝集素基因并对其氨基酸序列生物信息与已报道相关基因进行对比分析,为抗虫基因利用和转基因育种研究奠定基础。方法 根据已报道的植物凝集素基因序列设计特异引物,以半夏叶片DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,将其连接到测序载体上,进行序列测定,用分析软件分析序列信息。结果 克隆1 069 bp的半夏凝集素基因(pta),开放阅读框全长804 bp,编码268个氨基酸残基;预测相对分子质量和等电点分别为2.91×10⁴和7.77,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区;已在GenBank中登记（登录号AY725425）。结论 克隆的半夏凝集素基因序列信息完整,具有典型的甘露糖结合位点,可以作为抗虫基因用于抗虫育种。