特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:实现特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中高效表达、纯化并鉴定其生物学活性.方法:构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,转化感受态大肠杆菌DH5α,选择测序正确的阳性克隆进行扩增后,电转化酵母细胞,表达抗体二聚体,对表达抗体进行纯化、浓度检测,并鉴定其对肝癌细胞的结合活性,免疫组织化学检测二聚体对肝癌组织抗原的特异性.结果:测序显示成功构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,表达96 h抗体收获量最大,二聚体表达量为30 mg/L菌液,为大肠杆菌的300倍.抗肝癌单链抗体二聚体BDM与三种肝癌细胞结合,而与正常肝细胞不结合,结合效价为1:128.免疫组织化学显示二聚体与肝癌组织结合的阳性率比肝硬化、胃癌、正常肝组织高,差异有统计学意义.结论:成功制备了高表达量、高特异性、较好的活性及稳定性的抗肝癌单链抗体二聚体BDM,为制备免疫纳米颗粒及开展肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础.     

免疫-PCR检测肾综合征出血热患者血清中抗核衣壳蛋白抗体方法的建立

目的　建立高灵敏性和高特异性的免疫 -PCR方法检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中抗核衣壳蛋白抗体。方法　用汉坦病毒 ( 76 - 118株 )重组核衣壳蛋白为抗原包被聚苯乙烯微滴度板 ,与经ELISA法和临床均已确诊为HFRS患者的血清进行抗原抗体特异性反应 ,以链霉亲和素为桥梁将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA指示分子相连 ,PCR扩增DNA指示分子 ,通过检测指示分子DNA来反映肾综合征出血热患者血清中抗核衣壳蛋白抗体的水平 ,并与传统的ELISA法进行比较。结果　免疫 -PCR检测肾综合征出血热患者血清中抗核衣壳蛋白抗体的敏感性是ELISA法的 2 5 0 0 0倍 ;30例HFRS阳性患者血清免疫 -PCR检测均为阳性 ,2 0例甲型肝炎阳性血清和 2 0例正常人血清免疫 -PCR检测均为阴性。结论　免疫 -PCR方法敏感性高 ,特异性强 ,有可能作为一种高敏感性的检测方法用于HFRS的临床辅助诊断     

80例乙型、丙型病毒性肝炎血清、组织基因芯片检测分析

研究病毒性肝炎基因芯片的制备，用肝炎基因诊断芯片，病毒抗原抗体检测方法，免疫组织化学法和原位分子杂交法，分别检测乙型肝炎和丙型肝炎血清及肝组织，比较各种方法的优缺点，将带荧光标记的PCR产物用点样仪点于玻片介质上，并经过点样处理后制备成基因芯片，收集乙型肝炎血清40例，肝组织20例，丙型肝炎血清20例，健康人血清40例，乙型肝炎确诊用雅培设备试剂，丙型肝炎检测抗HCV及HCV-RNA，确诊后同健康人血清一起进行双盲混合编组，用基因诊断芯片检测，20例乙型肝炎肝组织用免疫组织化学和原位分子杂交法，检测HBcAg和HBVDNA。同时用基因芯片检测，40例乙型肝炎病毒标志物阳性血清，基因诊断芯片检测阳性30例，阴性10例，20例丙型肝炎血清基因芯片检测阳性8例，40例健康人血清，乙型和丙型肝炎基因诊断芯片检测均阴性，20例肝组织免疫组化发现HBcAg阳性20例，原位分子杂交发现HBVDNA阳性18例，基因芯片检测阳性18例，肝炎基因诊断芯片可以同时检测乙型和丙型肝炎，诊断乙型肝炎血清准确率可达80%，假阳性率低。诊断丙型肝炎阳性率低，技术有待完善。     

抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定

目的采用重组抗原从人源化单链抗体库(Human single fold scFv library)中筛选和鉴定抗弓形虫主要表面抗原1(rSAG1)的单链抗体,对其特异性的弓形虫靶向作用进行分析,为弓形虫靶向生物治疗提供靶向分子。方法以重组SAG1融合蛋白作为包被抗原对噬菌体抗体库进行3轮固相筛选,获得抗rSAG1融合蛋白的阳性克隆;用纯化的原核表达载体pET-32C的亲和标签(Trx-His-Stag)、鼠可溶性抗原和大肠杆菌抗原对上述阳性克隆进行差异筛选,获得能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆;差异筛选获得的特异性阳性克隆转染大肠杆菌HB2151进行诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,获得能分泌抗rSAG1单链抗体(anti-rSAG1scFv)的阳性噬菌体克隆;DNA测序分析抗rSAG1的单链抗体基因序列。用Ni2 螯合柱亲和纯化rSAG1单链抗体,并用免疫印迹技术(Westernblot)对纯化的抗rSAG1单链抗体进行免疫反应性检测;免疫组化检测rSAG1单链抗体对弓形虫速殖子的靶向作用。结果经过rSAG1抗原的固相筛选后获得24株阳性克隆,差异筛选后获得5株能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆,其中有3株分泌性表达抗rSAG1的单链抗体,DNA测序和Genbank比对表明其为3株不同的抗弓形虫主要表面抗原1的单链抗体;West-ernblot表明亲和纯化的单链抗体能较好结合rSAG1;免疫组化显示抗rSAG1单链抗体可与弓形虫速殖子结合。结论利用噬菌体抗体库技术获得的特异性人源rSAG1单链抗体与弓形虫速殖子有较强的结合能力,这对弓形虫的靶向生物治疗具有潜在应用价值。     

基因芯片技术检测慢性乙型肝炎肝硬化患者肝组织及血清HBVDNA研究

目的研究DNA芯片技术在检测乙型肝炎和肝硬化患者肝组织及血清中HBVDNA的应用，并与雅培试剂、免疫组织化学和原位分子杂交法比较。方法用点样仪将PCR扩增的HBVDNA探针制成基因芯片。对15例慢性乙型肝炎(下称慢乙肝)患者的血清及肝活检组织、99例乙型肝炎后肝硬化肝组织，分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法、雅培试剂检测HBVDNA、HBcAg、HBsAg、HBeAg。结果15例慢乙肝HBsAg、HBeAg阳性患者的乙型肝炎血清基因芯片检测均阳性。15例肝组织标本中，免疫组化法HBcAg阳性15例，HBVDNA原位分子杂交阳性14例。基因芯片检测阳性14例。99例乙型肝炎后肝硬化肝组织标本中，HBcAg阳性67例、HBVDNA阳性53例，基因芯片检测阳性46例；32例HBcAg、HBVDNA阴性组织基因芯片检测均阴性。结论肝炎基因诊断芯片可以检测肝组织及血清HBVDNA，其诊断准确率高，假阳性率低。     

人源抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2单链抗体的研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2（HCVE2）的人源噬菌体单链抗体，并探讨其临床价值。方法 以重组的HCVE2为固相抗原，利用亲和筛选的原理，从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）和DNA序列分析。获得HCVE2的人源单链抗体；用该抗体对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组织化学鉴定。结果 ELISA结果表明，制备的HCVE2人源单链抗体（吸光度值A450为1.88)能与HCVE2抗原特异性结合，免疫组织化学结果表明，该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCVE2抗原，与正常肝组织及乙型肝炎病毒（HBV）抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为HCVE2病原的检测提供了新的有效的试剂。     

SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究

目的建立鼻咽癌细胞核酸适配子库,为鼻咽癌的分子诊断、生物治疗奠定基础。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,采用SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮筛选。采用流式细胞仪检测判断核酸适配子库的特异性和亲合力,Clustal X软件分析适配子序列。结果流式细胞仪检测显示亚文库与靶细胞的结合能力随筛选轮数的增加荧光强度增强。聚类分析显示适配子可以分为3个家族,1、2家族具有保守序列。结论 EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库初步建立成功,可筛选到具有较高亲和力和特异性的核酸适配子;本研究为鼻咽癌的分子诊断、生物治疗奠定了基础。     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬菌体抗体库的初建

目的 建立抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬体抗体库,为进一步获得功能性抗体可变区基因,制备单链抗体和单链抗体－辣根过氧化物酶融合蛋白,用于甲状腺自身免疫性疾病的治疗和检测打下基础,方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗甲状腺刺激性免疫球蛋白的杂交瘤细胞中扩增出轻重链可变区基因,与噬粒表达载体ｐ３ＳＣＭＨ连接,转化大肠杆菌,以甲状腺刺激性免疫球蛋白阳性患者血清ＩｇＧ为抗原对表达的噬菌体抗体进行筛选,结     

低度恶性子宫内膜间质肉瘤14例病理特点分析

采用HE及免疫组织化学染色法分析14例低度恶性子宫内膜间质肉瘤(LGESS)的临床病理特点,结果HE染色示肿瘤组织成巢团样浸润,肿瘤细胞呈圆形、卵圆形或梭形,肿瘤内有大量小血管;免疫组织化学染色(8例)示CD10均阳性,角蛋白均阴性;4例波形蛋白阳性,3例ki-67抗体阳性指数<40%;2例伴性索样分化者ER、PR阳性,3例伴平滑肌分化者中2例SMA阳性,1例结蛋白阳性.提示LGESS确诊主要依靠组织病理学和免疫组织化学检查;CD10是一种比较特异的标记.     

蛋白芯片技术对肝细胞癌组织蛋白谱的建立及标志蛋白的筛选

目的:应用表面增强激光解吸附电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)对肝细胞癌组织的蛋白表达谱进行分析,从中筛选出标记蛋白.方法:采用CM10芯片及SELDI-TOF-MS技术对肝细胞癌组织26例和肝硬化组织18例进行蛋白指纹图谱检测分析;比较高、中、低分化肝细胞癌组织,不同TNM分期肿瘤以及AFP阴、阳性肝细胞癌组织的蛋白表达差异,所得结果均采用Biomarker Wizard软件进行分析;通过查询蛋白库,对特定分子质量所对应的标记蛋白进行初步确定.结果:肝细胞癌和肝硬化组织蛋白表达图谱之间存在16个稳定的标志蛋白,7个蛋白在肝细胞癌组织中表达上调.9个蛋白在肝细胞癌组织中表达下调,其中4.7 kDa,7.2 kDa和9.8 kDa蛋白峰差异性最明显;中分化和高分化肝细胞癌之间存在11个标志蛋白;通过查询蛋白库ExPasy并进行筛选,初步确定特定分子质量所对应的蛋白.结论:采用SELDI-TOF-MS技术,证实在肝细胞癌组织中存在多种高度特异性低分子蛋白.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.