真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达

目的 :构建肿瘤抑制基因DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO - 8910中 ,并得到稳定表达。方法 :利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段 ,将其正向连接入真核表达载体pIRES2 -EGFP ,并通过酶切鉴定。用脂质体介导的方法 ,将真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93转染人卵巢癌细胞系HO - 8910 ,通过G4 18筛选稳定表达克隆 ;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC - 2蛋白在卵巢癌细胞系HO - 8910中的表达。结果 :构建了DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,并通过酶切鉴定。在荧光显微镜下 ,转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910发出绿色荧光 ,荧光全部集中于胞浆内。免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910胞浆呈棕黄色 ,而转染空载体的细胞呈阴性染色。结论 :成功构建了真核表达载体转染了pIRES2 -EGFP -p93,并在人卵巢癌细胞系HO - 8910中稳定表达 ,为研究DOC - 2蛋白对卵巢癌细胞的作用奠定了基础     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

肌损伤基因治疗中的质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD的构建及其在MSCs中的表达

目的：构建鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2—EGFP—MyoD，为研究MyoD对肌损伤的修复作用提供物质基础。方法：从质粒EMSV上用EcoRI酶切下MyoD cDNA片段，进行琼脂凝胶电泳，切胶回收纯化；EcoRI酶切pIRES2—EGFP，将线性化的载体与回收MyoD cDNA片段用T4 DNA连接酶连接，克隆出双顺反子质粒截体pIRES2—EGFP—MyoD，用Hind Ⅲ 酶切对重组质粒进行鉴定：用脂质体转染的方法将重组质粒转入间充质干细胞(meaendhymal stem cells,MSCs)中，G418筛选，在荧光显微镜下观察其表达。结果：凝胶电泳证明将MyoD cDNA亚克隆入pIRES2—EGFP内，荧光显微镜下可MSCs胞体发出绿色荧光。结论：成功地构建了鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2—EGFP—MyoD。     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

乙型肝炎病毒e抗原在肝细胞内作用蛋白AK026018亚细胞定位的研究

目的：确定肝细胞内乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)作用蛋白AK026018的亚细胞定位，初步研究该蛋白的生物学功能。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因，构建真核表达载体pEGFP-AK，转染HepG2、293T细胞系，在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞比较观察。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察，转染了重组栽体pEGFP-AK的细胞绿色荧光信号较集中分布于胞浆中。而空载体pEGFP-N1转染的细胞绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。结论：成功分离了AK026018全基因序列并构建了真核表达载体，该基因表达产物亚细胞定位于细胞浆中。     

阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2δEGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法 以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达.结果 测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光.应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

逆转录病毒介导hBMP7基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达

采用粘－粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体,重组质粒转染包装细胞PT67后,制备含目的基因的重 逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示,hBMP7逆转录病毒载体中外源基因插入方向正确、无碱基错误和缺失。原位杂交和免疫组织化学检测表明,感染后2天经基因转染的BMSc原位杂交和免疫组化检测结果呈阳性,未经转染的细胞检测结果呈阴性。转染的BMSc经G418筛选至4周仍有外源BMP蛋白的表达。提示采用逆转录病毒介导方法转染的BMSc中可有源性BMP7mRNA和蛋白的表达。     

2-CAT: 2-concentric arc technique

We used conventional three-dimensional (3D) planning software and blocking to design a radiation dose distribution in the shape of a hollow sphere. The technique, known as 2-CAT, employs arcing beams with blocking of the center of the field, along with partial transmission blocking of the poles of the portal. The central core can subsequently be irradiated to deliver a relatively even dose to the entire volume. The technique differs from conventional planning in that the central portion of the tumor, while surrounded, is not included in the initial treatment volume. The clinical usefulness of the method will require future testing, as the technique has not yet been clinically proven..     

T—2四醇和T—2五醇的制备

目的：进一步探讨Ｔ－２毒素与其结构效应的关系，制备Ｔ－２毒素的两个衍生物。Ｔ－２和Ｔ－２五醇。     

Synthesis of no-carrier-added fluorine- 18 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose

A new synthetic procedure for the preparation of fluorine- 18 2-fluoro-2-deoxy-glucose has been developed. This procedure offers the advantages of flexibility in the source of the fluorine- 18, high yields, and short synthesis times. The procedure works at the no-carrier-added level and gives a product of very high specific activity.     

New high-yield synthesis of 18F-labelled 2-deoxy-2-fluoro-D-glucose

A new high-yield synthesis for the production of 18F-2-FDG has been developed by reacting 18F-labelled acetyl hypofluorite, prepared by in situ reaction of 18F-molecular fluorine with sodium acetate in glacial acetic acid, and tri-acetyl-D-glucal at room temperature. Molecular fluorine labelled with 18F was produced by a 20Ne(d, alpha) 18F reaction. 1,3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-fluoro-D-glucopyranose is extracted with methylene chloride, evaporated to dryness and hydrolyzed, yielding 98% radiochemically pure 18F-2-FDG. Overall radiochemical yield is about 24 +/- 3%. The specific activity of the final product at the end of synthesis is about 25.38 GBq/mmol (685 mCi/mmol). The synthesis time is approximately 60 min. The synthesis proves that small medical cyclotrons are able to produce 18F-molecular fluorine at the levels needed for the synthesis of 18F-2-FDG used in functional imaging with positron emission tomography.     

VO2 responses to running speeds above VO2max

This study compared VO2, heart rate (HR) and electromyographic (iEMG) responses to speeds above the velocity associated with VO2max (v-VO2max). Eight male, middle-distance runners performed a graded exercise test to determine VO2max and v-VO2max and runs to fatigue at 100 % and 110 % v-VO2max. Breath-by-breath VO2 and HR were continuously recorded; lactate [La (-)] measured pre- and post-run and iEMG measures of rectus femoris (RF) and vastus lateralis were recorded during the first and last 20 s of each run. Analysis indicated longer time to fatigue in the 100 % v-VO2max run with no differences between conditions for VO2 or HR amplitudes or post-run [La (-)] (p > 0.05). There were significantly faster tau values (p < 0.05) in the 110 % condition in VO2 and HR. No significant correlations were observed between VO2 or HR tau values and time to fatigue. RF iEMG was significantly larger in 110 % compared to 100 % run in the first 20 s (p < 0.05). While no association between treadmill performance and VO2 response was evident, faster running speeds resulted in faster VO2 and HR responses, with no difference in amplitude or % VO2max attained. This may potentially be as a result of an increased muscle fibre recruitment stimulus during the faster running velocity resulting in faster cardiodynamic responses.