骨髓源干细胞参与的血管内皮更新

背景：研究表明骨髓源干细胞可塑性强,但其参与组织更新及修复的机制在转分化及细胞融合间尚存在争议。 目的：通过性别交叉骨髓移植建立雌雄嵌合体小鼠模型,观察骨髓源性干细胞是否参与内皮细胞的更新并探讨其可能的机制。 方法：采用雌性C57BL/6-GFP小鼠为供体,雄性C57BL/6小鼠为受体进行骨髓移植建立嵌合体小鼠,并应用流式细胞术分析骨髓嵌合情况。骨髓移植后20周采用Y染色体荧光原位杂交法对脑、肾、肝、脾及心脏组织Y染色体进行标记,荧光显微镜观察各组织器官中血管内皮细胞Y染色体及绿荧光蛋白表达情况。 结果与结论：①嵌合体小鼠骨髓细胞流式细胞学检测显示移植骨髓后1周骨髓GFP⁺细胞为(7.48±1.38)%、4周时达(73.92±5.57)%,结果表明成功建立性别交叉骨髓移植模型。②骨髓移植后20周嵌合体小鼠脑、肾、肝和脾组织血管壁可见绿荧光蛋白表达,且部分细胞同时表达Y染色体,表明发生骨髓源细胞和血管内皮细胞融合。脑实质及心肌组织未见绿荧光蛋白表达。结果提示骨髓源干细胞可能通过细胞融合机制参与不同组织器官中血管内皮细胞的更新。     

小鼠骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞的转化

为探讨小鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)在体内向肝细胞转化的可能性,将来源于6-8周龄雄性BALB/c小鼠的BMSCs,通过尾静脉注射或经皮肝穿刺直接注入肝脏组织的途径移植入同源正常雌鼠体内。分别于移植术后1、2、4周处死受体雌鼠,取其肝组织,通过荧光原位杂交法(FISH)和免疫组化法同时检测Y染色体的存在和白蛋白的表达,以观察确定所注入的BMSCs在受鼠体内向肝细胞转化的情况。采取经皮直接肝穿刺注射途径移植BMSCs的两个实验组,无论移植细胞是新鲜分离的、还是P3代BMSCs,均可于移植后1周,在受鼠肝脏内检出Y染色体阳性细胞的存在,此类阳性细胞并可同时表达白蛋白。另一方面,经尾静脉注射法进行移植的实验组,于移植后2周,也可在其肝组织内检测到同时表达Y染色体和白蛋白的细胞。本研究证明了骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞转化的可能性。     

雌性小鼠骨髓移植给雄性小鼠后内源性骨髓细胞残存状态的研究

 目的:以雌性小鼠骨髓移植给雄性小鼠的方法,通过检测雄性小鼠血细胞的Y染色体来明确内源性骨髓细胞的残存状态。方法:将雌性或雄性C57BL/6小鼠作为受体,实验组用［137Cs］照射,6 h后每只经尾静脉注射供体小鼠骨髓细胞1×107。统计骨髓移植后14 d动物的存活率,并通过眶静脉采血观察外周血白细胞数量的变化,检测受体雄性小鼠体内Y染色体基因水平的变化以明确骨髓移植的效果。结果:分别用1 000、950和900 rad的照射剂量对受体小鼠进行照射后将供体小鼠的骨髓移植到受体小鼠体内,1 000和950 rad剂量时雌性受体小鼠可迅速恢复造血功能,而雄性受体小鼠则仅有48%的存活率。900 rad照射剂量骨髓移植后,雄性受体小鼠迅速恢复了造血功能,13 d后外周血白细胞计数基本恢复正常。移植后的雄性受体小鼠在5周内已检测不到外周血细胞Y染色体基因,表明雄性受体小鼠的骨髓被完全破坏,雌性供体小鼠的骨髓可完全替代受体雄性小鼠的骨髓并且发挥造血功能。结论: 在照射剂量900 rad照射后,雄性小鼠可以作为骨髓移植受体,为将来应用雄性小鼠作为骨髓移植受体动物开展有关心血管疾病的研究奠定了实验基础。     

小鼠Y染色体RNA探针的标记和应用

目的标记小鼠Y染色体RNA探针，检验该探针在检测外周血涂片和脑组织切片Y染色体阳性细胞的效率。方法以小鼠Y染色体重复序列pY353/B cDNA为模板标记RNA探针。以雌性小鼠为对照，用原位杂交法检测小鼠外周血涂片Y染色体阳性细胞；用荧光原位杂交法检测雄性小鼠脑组织切片Y染色体阳性细胞。结果Y染色体原位杂交法在外周血涂片Y染色体阳性的检测灵敏度和特异度均为100％，在脑切片检测Y染色体阳性细胞的灵敏度和特异度分别为85．67％和100％。结论小鼠Y染色体RNA探针的原位杂交和荧光原位杂交法检测Y染色体阳性细胞有较高的灵敏度和特异度。     

小鼠干细胞抗原阳性胎肝细胞在受体鼠脑组织中的分化

为了解胎肝干细胞是否具有向神经组织细胞分化的潜能 ,本研究采用免疫磁珠法分离雄性胎鼠肝组织中干细胞抗原 1(stemcellantigen ,Sca 1)阳性细胞 ,尾静脉注射Sca 1+ 细胞 (2 0× 10 3个 小鼠 )到经致死剂量 (10 0Gy)放射线照射的 10～ 12周C5 7BL 6J雌性小鼠。免疫组化和FISH双染色检测结果显示移植 2、4、6月后受体雌鼠脑组织内存在大量Y染色体阳性细胞 ,约占脑组织总细胞为 4 5 %± 0 5 % ,分布包括 :侧脑室脉络膜丛、脑室室管膜、大脑白质灰质、小脑等。这些Y染色体阳性细胞表达神经组织细胞特异标志 ,如神经元特异核蛋白 (Neuron specificnucleiprotein ,Ne uN)、神经纤维细丝蛋白M(neurofilament 16 0Ka,NF M)、微管蛋白Ⅲ (tubulinⅢ ,TuJ 1)、或者胶质纤维酸性蛋白 (Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)等 ,其中Y染色体和NeuN均阳性的细胞为 1 2 %± 0 3%、Y染色体和GFAP均阳性的细胞为 1 0 %± 0 2 %。这说明胎肝Sca 1+ 细胞能迁移进入脑组织 ,并且分化成神经细胞和星形胶质细胞。     

骨髓间充质干细胞作为干细胞参与生物材料异位诱导成骨

背景:体内骨组织工程是在骨或非骨部位植入具有骨诱导活性的生物材料,利用机体作为生物反应器去构建组织工程骨,以修复骨缺损。骨移植物所具备的优良生物相容性和机械性能为骨移植开辟新的治疗途径。然而,其相关干细胞来源尚不清楚。目的:探索骨髓间充质干细胞作为干细胞是否参与生物材料的异位诱导成骨。方法:分离纯化雄性beagle犬的骨髓间充质干细胞。将培养至第3代骨髓间充质干细胞移植入雌性beagle犬体内,建立同种异体骨髓移植模型,同期将双相钙磷陶瓷植入受体犬竖脊肌内。6周后,获取骨构建物标本,利用原位荧光杂交技术对骨移植物Y染色体进行示踪。结果与结论:原位荧光杂交结果显示Y染色体在骨构建物中有荧光信号表达,表明骨髓间充质干细胞可通过血液循环途径募集到异位生物材料处,形成骨组织。结果提示骨髓间充质干细胞参与生物材料异位诱导成骨,是生物材料异位诱导成骨干细胞来源之一。     

骨髓源性干细胞向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞分化的研究

目的:观察骨髓源性干细胞能否向慢性马兜铃酸肾病(CAAN)大鼠肾小管上皮细胞分化。方法:雌性Wistar大鼠30只,随机分移植组、非移植组和正常对照组,每组10只,移植组和非移植组经关木通水煎剂灌胃12周,制作CAAN大鼠模型,第12周末,移植组经尾静脉输入骨髓干细胞1×108个/只(约0.35 mL/只),非移植组经尾静脉输入0.35 mL生理盐水;正常对照组,先用饮用水灌胃12周,然后经尾静脉注射等量(0.35 mL)生理盐水。第16周分别处死大鼠。大鼠在处死时留取血、尿、肾组织标本。肾组织连续切片,做免疫荧光(IF)染色结合Y染色体荧光原位杂交(Y-FISH)检测观察移植组大鼠肾组织中骨髓源性干细胞的分化情况。结果:第16周,移植组大鼠肾组织中可见Y+CK18+及Y+RCAI+双阳性细胞,非移植组未见到Y+细胞。结论:骨髓源性干细胞具有向CAAN大鼠肾脏小管上皮细胞分化的潜能。     

内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后的迁移、归巢与分化

背景：目前的大多数研究主要集中在移植外源干细胞来源的心肌细胞对受损心肌进行修复与再生,而有关内源干细胞迁移、归巢及分化的研究比较少。 目的：观察内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后迁移、归巢以及分化情况。 方法：成年雌性C57BL/6小鼠随机分为2组：心肌梗死组(n=4)小鼠建立骨髓重建模型,于骨髓重建4周后行冠状动脉左前降支结扎术建立急性心肌梗死模型,1周后处死;对照组(n=3)小鼠进行单纯骨髓重建,于骨髓重建4周后处死。取心脏组织,采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin Ⅰ的表达,观察心肌梗死后表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞在心肌组织中的分布、分化情况。 结果与结论：骨髓重建小鼠心肌梗死组与对照组均可见到发绿色荧光的骨髓间充质干细胞,心肌梗死组骨髓间充质干细胞数量比对照组明显增多。两组切片均可见部分骨髓间充质干细胞呈GFP、Troponin Ⅰ和PI三阳性,心肌梗死组三阳性的细胞比对照组明显增多,表明心肌梗死后内源骨髓间充质干细胞能迁移、归巢到受损的心肌组织并获得心肌分化表型。     

骨髓间充质干细胞和心脏Sca1阳性细胞移植治疗心肌梗死的效果比较及其机制研究

目的探讨骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)和心脏来源的Sca1阳性干细胞移植对小鼠急性心肌梗死后的心功能恢复的影响。方法分别从成年C57BL/C小鼠的骨髓分离获取骨髓间充质干细胞,从心脏利用流式分选获取Sca1阳性干细胞,并在体外进行培养、扩增。C57BL/C小鼠雄性小鼠24只,按照以下方式分组,每组6只,假手术组,生理盐水对照组,MSCs治疗组和Sca1阳性细胞治疗组。小鼠麻醉后开胸,利用结扎心脏冠状动脉的左前降支建立急性心肌梗死模型,建模成功后分别在梗死区周围心肌内注射上述细胞或者生理盐水,假手术组小鼠不结扎冠状动脉。4周后,利用心脏超声观察小鼠左心室射血分数(LVEF)以及左心室舒张末期容积,以此评估心功能改变。细胞培养至第4代,采用荧光半定量PCR的方式分析细胞表达血管内皮生长因子(VEGFa和VEGFb)的情况。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁生长,呈梭形;Sca1阳性干细胞在心脏组织的阳性率约为18%,培养后细胞贴壁生长,成短梭形,形态较MSCs更饱满。在细胞移植治疗后,与Sca1阳性干细胞治疗相比,MSCs治疗可以增加心梗后小鼠的存活率。细胞移植治疗4周后,骨髓来源MSCs治疗组的LVEF明显高于心脏来源Sca1阳性干细胞,且更有利于减少心梗后左心室舒张末期容积的扩大,改善心肌重塑。骨髓来源的MSCs表达VEGFa和VEGFb明显高于Sca1阳性细胞。结论心脏来源的Sca1阳性干细胞和骨髓来源的MSCs均可提高LVEF,促进心功能的恢复,且后者优于前者,这可能与MSCs高表达VEGF有关。     

髓腔内骨髓移植诱导异基因小鼠皮肤移植耐受的研究

探讨髓腔内骨髓移植(IBM-BMT)对异基因小鼠皮肤移植耐受的诱导效果。受鼠为雌性C57BL/6(H-2b,B6)小鼠,于第0天接受60Coγ射线全身照射(TBI),4 h内输注雄性BALB/c(H-2d)小鼠来源的骨髓细胞(BMC),2 d后腹腔注射环磷酰胺(CTX)。通过皮肤移植、混合淋巴细胞反应(MLR)检测耐受状态,并通过骨髓染色体分析了解BMC的植入程度。结果显示,接受IBM-BMT的B6小鼠对BALB/c小鼠的皮肤移植物平均存活时间(MST)超过300 d,显著长于其余两组(P<0.001);MLR结果证明,实验组B6小鼠获得供体特异性耐受,在耐受小鼠骨髓中可检测到一定比例的Y染色体存在。以上表明髓腔内骨髓移植可以保证异基因骨髓细胞的植入并形成混合嵌合状态,从而有效地诱导免疫耐受。     

骨髓间充质干细胞移植对木瓜蛋白酶和［60Co］照射所致大鼠肺气肿的作用

目的：研究骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对木瓜蛋白酶和［⁶⁰Co］照射所致肺气肿的影响及其机制。方法：雌性大鼠随机分为对照组、肺气肿组和肺气肿+MSCs移植组。将大鼠进行［⁶⁰Co］照射，在气管内滴入木瓜蛋白酶建立雌性大鼠肺气肿模型，然后将培养的雄性大鼠MSCs经尾静脉注射到雌性肺气肿大鼠。观察移植后大鼠肺组织的病理学变化；通过PCR和Y染色体荧光原位杂交（Y-FISH）示踪雄性大鼠MSCs在雌性肺气肿大鼠肺组织内的植入情况；用Y-FISH和肺泡表面活性物质蛋白C（SP-C）免疫荧光显色方法检测雄性大鼠MSCs在受体肺组织内是否分化为II型肺泡上皮细胞。结果：肺气肿组、肺气肿+MSCs移植组大鼠均出现肺气肿改变，但后者较前者的肺气肿明显减轻，2组之间的肺泡平均内衬间隔、平均肺泡面积和单位面积肺泡数均有显著差异；PCR结果显示肺气肿+MSCs移植组的大鼠肺脏基因组DNA中可以扩增出位于Y染色体的Sry基因片段；Y-FISH显示肺气肿+MSCs移植组的雌性大鼠肺组织中有Y染色体阳性的细胞，并且部分Y染色体阳性细胞同时表达SP-C。结论：MSCs移植能够减轻木瓜蛋白酶和［⁶⁰Co］照射所致的肺气肿，这可能与移植的MSCs在受体肺组织中的植入和分化为II型肺泡上皮细胞有关。     

Homing of transplanted bone marrow cells in livers of Schistosoma mansoni‐infected mice

Elkhafif N, Voss B, Hammam O, Yehia H, Mansy S, Akl M, Boehm S, Mahmoud S, El Bendary O, El Fandy G. Homing of transplanted bone marrow cells in livers of Schistosoma mansoni‐infected mice. APMIS 2010; 118: 277–87. The efficiency of differentiation of bone marrow cells (BMCs) into hepatocytes in vivo and its importance in physiopathological processes is still debated. Murine schistosomiasis was used as a liver injury model and unfractionated male mice BMCs were transplanted through intrahepatic injection into non‐irradiated Schistosoma mansoni‐infected female mice on their 16th week post‐infection. Two weeks after bone marrow transplantation, mice were sacrificed on a weekly basis until 10 weeks. Tracing of male donor‐derived cells in female recipient mice livers was carried out by the detection of Y chromosome expression by fluorescent in situ hybridization (FISH) and also of chromodomain Y‐linked (CDYL) protein by indirect immunofluorescence (IF). Their transformation into hepatocytes was studied by double labelling indirect IF using antibodies directed against CDYL and mouse albumin. Histopathological and electron microscopic examinations revealed the presence of small hepatocyte‐like cells in the periportal tracts and in between the hepatocytes facing the sinusoids. Donor‐derived cells showing Y chromosome by FISH and expressing CDYL protein by IF were recovered in the infected transplanted livers. The initial number of these cells increased with increased post‐transplantation time. Cells were mainly localized in the periphery of schistosoma granuloma. Few donor‐derived cells appeared within the hepatic parenchymal tissue and showed positivity for albumin secretion by double labelling with IF. We suggest that transplanted bone marrow stem cells can repopulate the Schistosoma‐infected liver of immunocompetent mice. Their differentiation is a complex event controlled by many factors and needs to be further characterized extensively. The extent and type of liver injury and the number of transplanted cells are important variables in the process of stem cell engraftment and differentiation into functioning hepatic cells that still need to be defined.     

骨髓干细胞移植治疗不同年龄mdx鼠的疗效研究

目的：研究不同年龄的Duchenne型肌营养不良鼠（mdx鼠）与骨髓干细胞移植后缺失蛋白表达的关系。 方法： 获取4-5周C57BL/6小鼠的骨髓干细胞，体外培养3 d，静脉移植到7Gy γ射线预处理的6周龄、8周龄两组各6只mdx鼠。移植12周后，对移植鼠骨骼肌dystrophin蛋白表达情况进行检测。 结果： 6周龄、8周龄两组mdx鼠，静脉移植1.2×107骨髓干细胞，3个月后，分别有16%和7%的骨骼肌纤维表达了dystrophin蛋白。 结论： 静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞的mdx鼠，3个月之后, 不同年龄mdx鼠骨骼肌细胞dystrophin蛋白表达的阳性率不同，幼年鼠骨髓干细胞移植有较高比率的缺失蛋白表达。     

骨髓间质干细胞诱导为神经元样细胞移植治疗脑梗塞模型大鼠后运动功能的改善

目的:观察骨髓间质干细胞诱导为神经元样细胞移植对大脑中动脉阻塞模型（MCAO）鼠后运动功能的改善情况。 方法:采用分离消化法对Fischer344大鼠的骨髓间质干细胞进行体外培养、纯化鉴定后，进行诱导分化，局部立体定位注射于MCAO大鼠纹状皮质18区，对照组注射无血清L-DMEM基础培养液。分别于诱导细胞移植后第2周及第8周，进行网屏握持试验、抓握牵引试验、平衡木行走试验及Morris水迷宫测试，并取脑组织做2,3,5-三苯四唑化氯（TTC）染色。 结果:移植后第2周及第8周对照组、实验组于水迷宫试验中找到目标的时间（s）及路径（cm）均有显著差异（P<0.05）；第8周时实验组与对照组相比网屏握持、抓握牵引及平衡木行走等试验的时间（s）亦存在显著差异（P<0.05）。 结论:诱导细胞的移植对MCAO模型大鼠的运动功能有明显恢复作用。     

骨髓间充质干细胞移植后在mdx鼠体内的分布研究

目的： 研究骨髓间质干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)后体内各主要器官的分布状况。方法: 取第5代SD大鼠骨髓间质干细胞，应用［3H］－TdR标记后以2×107cells／只细胞尾静脉移植到经7Gy γ射线预处理后的7-9周龄mdx鼠体内，分别于移植后24 h、48 h、4周、8周和16周测定血液、肺、肝、骨髓、骨骼肌及心肌的放射性分布计数。结果: 经7Gy γ射线放疗预处理的mdx鼠，在尾静脉移植骨髓干细胞后，24 h肺的放射性分布计数最高，为36.70±3.04；48 h肝的放射性分布计数最高，为36.74±3.28；骨髓分布计数随移植时间延长增多，2周时达到高峰，计数为38.43±4.99，以后逐渐下降，但4月时仍明显高于其它组织器官，计数为13.45±1.37；骨骼肌、心肌的放射性分布计数随移植时间延长明显增高，16周时分别达到4.79±0.94和9.55±1.53。结论: 在MSCs移植后早期，MSCs主要分布于肺、肝等血流丰富的器官，随移植时间延长逐渐归巢到骨髓定居，2周时达到高峰，此后逐渐向损伤器官如骨骼肌、心肌等定向迁移，并且随时间延长分布增加，从而为MSCs定居于肌组织并且分化为肌细胞提供了证据。     

丹红注射液联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植修复受损脑组织的作用并不十分理想。 目的：观察丹红注射液联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的效果。 方法：用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型,随机分为3组,模型组尾静脉注射PBS、丹红注射液组尾静脉注射2 mL/kg丹红注射液、联合治疗组联合注射2 mL/kg丹红注射液+2.0×10⁹ L^-1的骨髓间充质干细胞悬液,连续5 d,1次/d。 结果与结论：在骨髓间充质干细胞移植后2周,联合治疗组神经功能评分明显优于模型组及丹红注射液组(P < 0.05);移植后3周联合治疗组大鼠脑梗死体积明显小于模型组和丹红注射液组(P < 0.05);病理组织学观察也可见联合治疗组的组织损伤减轻程度大于丹红注射液组和模型组。结果可见丹红注射液联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死疗效显著,可以对脑细胞起到保护作用。     

骨髓间充质干细胞移植治疗失神经肌萎缩

背景:外科显微镜手术和一些辅助治疗方法均无法通过修复损伤的神经细胞来有效延缓或治疗失神经肌萎缩。研究发现骨髓间充质干细胞具有定向分化潜能,并且在一定环境因素下能对损伤的组织进行修复,由此推测其可以对失神经萎缩肌肉起到一定的修复作用。目的:探讨移植骨髓间充质干细胞是否能够减轻和延缓失神经肌肉组织萎缩。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞经BrdU标记后用于移植治疗。将30只SD大鼠分为3组,每组10只,对每只大鼠左后肢进行手术。假手术组只暴露坐骨神经主干,不钳夹神经,移植治疗组、模型对照组钳夹坐骨神经主干后,向其支配的腓肠肌注射骨髓间充质干细胞悬液和不含胎牛血清的DMEM培养液。骨髓间充质干细胞移植后1,2周,采用BBB评分评价各组大鼠左后肢运动功能;骨髓间充质干细胞移植后14 d,取腓肠肌组织进行苏木精-伊红染色和BrdU免疫组化染色。结果与结论:第3代骨髓间充质干细胞BrdU标记为阳性;标记的骨髓间充质干细胞能在移植治疗组失神经损伤的肌肉组织中存活并起修复作用;相对于模型对照组,移植治疗组失神经肌纤维由相互融合重新恢复规整。结果表明移植骨髓间充质干细胞能够减轻和延缓失神经肌肉组织萎缩。