骨组织工程支架材料表面修饰的试验研究

观察骨髓基质细胞 (BMSC)在吸附了多聚赖氨酸 (Poly -L -Lysine,PLL)的羟基磷灰石 (HA)上的生长情况。探讨改进材料表面活性 ,促进种子细胞黏附和生长的方法。利用组织工程学的方法 ,将体外培养的BMSC种植于吸附了多聚赖氨酸的HA上 ,立体培养一周 ,用环境扫描电镜和倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。结果表明 ,细胞在体外可以立体培养成活 ,吸附了多聚赖氨酸的HA上细胞较多。多聚赖氨酸可以改善HA的表面活性 ,促进细胞的黏附和生长。     

成纤维细胞在PHB可降解材料上的粘附与生长研究

聚羟基丁酸酯（PHB）多孔材料可作为组织工程用的支架,然而细胞在此材料表面不易粘附生长,这与粘附蛋白在聚合物材料表面的吸附有关。基于材料表面的粘附与细胞生长、增殖、分化和组织发育密切相关,粘附强度可影响工程组织的最终结构与功能,本文通过对PHB材料进行多聚赖氨酸衣被,有效地实现了在PHB可降解支架上种植细胞来构建工程组织。用离心法制备厚度为20um的透明PHB薄膜,用多聚赖氨酸衣被,对照组为不衣被的PHB薄膜和玻璃片。接种成纤维细胞系NIH3T3,相差显微镜观察细胞的粘附生长过程。细胞在多聚赖氨酸衣被表面迅速粘…     

阳离子多聚物纳米基因载体系统的研究进展

阳离子多聚物能与DNA通过静电吸附作用而自组装成纳米微粒，保护DNA防止被核酸酶降解。阳离子多聚物由于具有合成简便、储存稳定、目的基因容量大、特异靶向性强、免疫原性低等优点被用作非病毒基因载体。阳离子多聚物按特性可分为两类：人工合成型和天然生物型。常见的人工合成型阳离子多聚物基因载体主要有：多聚左旋赖氨酸[poly(L-Iysine)，PLL]，多聚乙烯亚胺(polyethyIenimine，PEI)和星状树突体[PnIyamidnamine(PAMAM)dendrimers]等：天然生物型阳离子多聚物基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等。本文重点讨论了阳离子多聚物介导的基因导入细胞机理和基因进行靶向性转移的策略，详细论述了各种阳离子多聚物用作基因载体的性能特点，最后对非病毒基因载体的发展作出展望。     

新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

背景:骨髓干细胞富集材料是目前研究热点,制备并筛选一种新型骨髓干细胞富集材料对于组织工程学发展及临床应用至关重要。目的:制备并筛选一种骨组织工程新型骨髓干细胞富集材料,应用选择性细胞滞留技术观察其富集骨髓细胞的效果。方法:用预先制备的人脱钙骨基质与不同体积分数(0.01%,0.05%,0.1%,0.5%,1%)的多聚左旋赖氨酸复合制备多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料,应用选择性细胞滞留技术富集骨髓干细胞进行实验。激光显微共聚焦拉曼光谱分析、红外光谱分析鉴定材料成分;三维视频显微镜、扫描电镜观察富集材料孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构;对富集前后骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板进行计数分析。结果与结论:多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质富集材料孔隙率高,孔隙内部有大量孔隙相互连通,材料内外表面有乳白色均匀致密的多聚左旋赖氨酸涂层覆盖,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸制备的富集材料对人骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板的浓度富集倍数分别为(3.18±0.31)、(5.25±1.40)和(3.88±0.68)倍,相应的黏附率分别达(53±12)%,(73±13)%和(34±10)%,对纤维母细胞集落形成单位的选择率为1.41±0.34。结果证实,实验制备并筛选的经多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质具有天然骨海绵状支架网孔结构,对骨髓细胞的选择性滞留率高,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。     

钙磷多孔陶瓷表面明胶处理及体外细胞相容性

背景:烧结的钙磷多孔陶瓷由于其表面结构致密,在诱导细胞黏附和生长方面仍存在不足。目的:观察表面明胶处理对钙磷多孔陶瓷细胞相容性的影响。方法:以羟基磷灰石和磷酸钙为主要原料,采用有机泡沫浸渍工艺制备钙磷多孔陶瓷,然后将多孔陶瓷浸于5%的明胶溶液中进行表面处理。扫描电镜观察处理前后样品的孔隙形貌和表面结构,阿基米德法测试样品的孔隙率,WD-10A型电子万能材料试验机测定压缩强度;将材料与兔骨髓基质干细胞进行体外复合培养,通过MTT实验和扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。结果与结论:表面明胶处理后,多孔陶瓷的孔壁表面形成了较均匀的明胶涂层,样品的孔隙特征并没有受到显著影响。然而它们的平均压缩强度却从(1.04±0.15)MPa提高到了(5.17±0.17)MPa。扫描电镜观察和MTT实验结果表明,表面涂覆处理前后的多孔材料都具有良好的细胞相容性。与烧结的多孔陶瓷相比,表面明胶处理的样品更能增进细胞在材料表面的早期黏附和增殖。结果表明表面明胶处理在不破坏多孔陶瓷孔隙特征的情况下,不仅提高了钙磷多孔陶瓷的力学性能,而且改善了多孔陶瓷的细胞相容性。     

神经干细胞克隆在不同细胞外基质上的生长特性

目的：观察不同细胞外基质对培养神经干细胞生长特性的影响。方法：经体外扩增和传代，神经干细胞克隆被接种于多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸和鼠尾胶原形成的细胞外基质上，观察其增殖和迁移特性。结果：未经包被的塑料培养板作为基质时，体积较大的神经干细胞克隆才能贴壁，贴壁后的克隆仍呈球形，在其底部有细胞呈放射状迁出，数量逐渐增多，以梭形为主，细胞排列稀疏；多聚鸟氨酸和多聚赖氨酸作为细胞外基质时，迁移细胞排列密集，形态多样；鼠尾胶原作为细胞外基质时，促贴壁迁移的作用最差。当多聚赖氨酸和鼠尾胶原形成界限时可明显观察到鼠尾胶原对细胞迁移的抑制作用。结论：在各种基质上，克隆体积均可继续增长，但在鼠尾胶原上增长较慢。     

多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体条件下生物学特性的影响

背景：多聚赖氨酸可促进软骨细胞、表皮细胞的黏附、生长及增殖。 目的：观察多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体培养下生物学活性的影响。 方法：采用流式细胞仪检测昆明小鼠脂肪来源干细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达,将脂肪来源干细胞分别与经多聚赖氨酸表面修饰的珊瑚羟基磷灰石或空白珊瑚羟基磷灰石体外复合培养。 结果与结论：与空白珊瑚羟基磷灰石组比较,经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞较空白珊瑚羟基磷灰石组多,并分泌较多细胞基质,复合培养2,4,8 d的A值较明显增高(P < 0.05);但经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性值升高不明显(P > 0.05)。说明多聚赖氨酸能促进脂肪来源干细胞在珊瑚羟基磷灰石表面的黏附、生长和增殖,不影响脂肪来源干细胞向成骨细胞转化。     

多聚赖氨酸修饰钛氧膜并固定纤连蛋白对内皮细胞生长的影响

为了进一步提高钛氧膜与内皮细胞的亲和性,研究了一种表面生物化学方法对钛氧膜表面内皮细胞生长的影响.先利用盐酸和双氧水活化钛氧膜表面,使其产生羟基基团,再涂覆多聚赖氨酸作为中间过渡层,最后在表面上固定纤连蛋白.采用傅立叶红外光谱仪、X射线光电子能谱仪及接触角测量的方法对每步处理后的材料表面进行分析与测试.通过体外人脐静脉原代内皮细胞培养实验评价内皮细胞在样品表面的黏附和生长.研究结果显示,通过表面活化后涂覆多聚赖氨酸并固定纤连蛋白的方法能促进内皮细胞在钛氧膜表面的黏附和生长.     

不同浓度多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的实验研究

目的探讨多聚赖氨酸溶液对兔同种异体骨进行表面改性使其具有良好的细胞亲和力与最低细胞毒性的最佳浓度。方法使用浓度为100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚赖氨酸溶液,采取冻干法,分别对兔同种异体骨的微孔进行表面改性。根据多聚赖氨酸浓度,将兔同种异体骨分为100 mg/mL组、30 mg/mL组、1 mg/mL组、0.1 mg/mL组、0.025 mg/mL组和0.01 mg/mL组,同时,将未行表面改性的同种异体骨设为空白对照组。将兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别种植在各组同种异体骨内,并向成骨方向进行诱导和增殖。采用噻唑蓝(MTT)比色试验检测BMSCs在各组同种异体骨微孔表面的黏附、增殖情况,同时检测各组经诱导培养后的细胞表达碱性磷酸酶(ALP)的活性。结果在经不同浓度多聚赖氨酸溶液表面改性的同种异体骨中,空白对照组和0.01 mg/mL组BMSCs增殖及其表达ALP的活性明显小于其他各组(P 0.05),而其他各组之间差异无统计学意义(P 0.05)。结论从经济、有效方面考虑,多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的最佳浓度为0.025 mg/mL,该浓度可使同种异体骨具有良好的细胞亲和力与最低的细胞毒性。     

成纤维细胞在聚羟基丁酸酯表面黏附与种植研究

可降解高分子聚合物广泛应用于组织工程,其表面的黏附特性影响细胞的种植与生长。我们研究了成纤维细胞系NIH3T3在可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）表面的黏附和生长。应用线性变剪切流槽研究NIH3T3细胞在材料表面的黏附力学特性,结果表明,由于在PHB表面的临界脱离剪应力较低,高密度接种时间细胞趋于聚集;在经多聚赖氨酸衣被的表面临界脱离剪应力提高,细胞铺展生长。对三维PHB多孔支架种植细胞实验表明,在PHB材料表面进行多聚赖氨酸衣被,可以有效地提高细胞种植效率。     

壳聚糖-肝素静电自组装多层膜在钛表面进行的生物化修饰

背景:基于聚电解质阴阳离子交替组装的静电自组装技术可在温和、简单、易控的条件下实现多种生物大分子在材料表面的固定,已成为生物材料表面设计的重要手段。目的:利用静电自组装技术将具有生物活性的壳聚糖和肝素固定在钛表面,实现钛表面的氨基多糖生物化修饰,构建一种钛种植体材料的新型生物化表面,以改善钛的细胞相容性。方法:首先采用NaOH处理钛基材,获得多孔、负电荷的钛表面;然后吸附一层正电荷的聚赖氨酸;最后,多次交替吸附负电荷的肝素和正电荷的壳聚糖,形成以壳聚糖为最外层的多层膜结构。通过漫反射红外光谱扫描电镜和原子力显微镜对多层膜进行表征。并与成骨细胞共培养,观察成骨细胞的黏附、增殖以及分化情况。结果与结论:红外光谱、原子力显微镜、扫描电镜结果表明肝素-壳聚糖多层膜逐渐形成。此涂层可促进成骨细胞的黏附、增殖和分化。肝素-壳聚糖多层膜有望成为一种新型的生物化钛表面,从而改善钛表面的生物相容性。     

优化海藻酸钠-壳聚糖多孔复合支架用于人脐带来源间充质干细胞的体外扩增

目的通过制备及优化海藻酸钠-壳聚糖多孔复合支架用于人脐带来源的间充质干细胞体外扩增,为干细胞在组织工程中的应用与疾病治疗提供实验基础。方法通过制备海藻酸钠-壳聚糖多孔复合支架,并接枝多聚赖氨酸对其优化。然后,从产妇脐带中分离出间充质干细胞,接种在复合支架表面,监控其增殖情况。利用细胞计数法和CCK-8试剂盒,绘制细胞增殖曲线,并用β-半乳糖苷酶衰老检测试剂盒评估干细胞的衰老程度。结果成功制备并优化了海藻酸钠-壳聚糖复合支架,发现在接枝多聚赖氨酸的支架上接种间充质干细胞,细胞能够很好地附着,覆盖在复合支架表面,且能快速增殖。结论优化的海藻酸钠-壳聚糖多孔复合支架能为细胞增殖提供优良环境,具备体外扩增间充质干细胞的可行性,可作为组织工程应用的潜在材料。     

多聚赖氨酸和明胶对神经干细胞增殖和分化的影响

背景:目前大鼠神经干细胞体外诱导分化的研究报道诸多,但其分化过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低。目的:探索大鼠胚胎前脑神经干细胞体外原代及传代培养方法,并观察其分化规律。方法:胎鼠在无菌条件下分离出前脑,制备单细胞悬液,以1×1011L-1接种于含N2的DMEM/F12培养基中培养,传代培养过程中加入BrdU,标记神经干细胞球。诱导分化实验分为多聚赖氨酸铺板组、明胶铺板组和无铺板组。采用体积分数20%胎牛血清刺激其分化。免疫细胞化学检测nestin、BrdU及在血清诱导条件下神经干细胞向神经细胞分化的能力。结果与结论:细胞呈神经干细胞样生长,具有连续增殖能力,可以传代培养。传代神经球中的细胞均呈nestin阳性和BrdU阳性。多聚赖氨酸铺板组和明胶铺板组贴壁后分化为神经细胞能力强于无铺板组(P0.01)。多聚赖氨酸铺板组略强于明胶铺板组(P0.05)。神经谱系标记物神经胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的免疫细胞化学结果均阳性。结果表明,大鼠胚胎前脑富含神经干细胞,其分化观察,多聚赖氨酸和明胶在诱导神经干细胞分化中作为细胞贴壁支持物提高分化细胞数量的作用,且多分化为星形胶质细胞。     

两种体外培养基质对改良Bodian蛋白银染色和放射自显影术的影响

多聚赖氨酸和鼠尾胶原用作体外培养基质,对许多培养的组织块和细胞的贴壁生长起着重要的作用。本文观察和比较了这两种基质对培养物的改良Bodian 蛋白银染色和放射自显影术的影响:(1) 以多聚赖氨酸作为基质的交感神经元分离细胞培养标本,用改良Bodian蛋白银染色,其染色背景(基质部分)呈现较为均匀的淡蓝色,但以鼠尾胶原作为基质的染色标本,染色背景较易出现棕黑色的条纹或细网。(2) 以多聚赖氨酸作为基质的交感神经元分离细胞培养标本进行放射自显影术,被标记神经元的周围较少出现散在性的银粒(即本底),但在以鼠尾胶原作为基质的自显影标本中,被标记神经元的周围较常见到有许多散在性分布的本底。以上实验表明:(1) 以多聚赖氨酸作为基质对改良Bodian 蛋白银的染色效果影响较少,更利于分离培养神经元的形态学研究。(2) 在进行分离培养神经元的放射自显影术时,最好是使用多聚赖氨酸作为基质。已知多聚赖氨酸(poly-L-lysine)和鼠尾胶原两种基质(substratum)对许多体外培养的组织块和细胞,尤其是神经元的贴壁生长起着重要的作用。但是,有关多聚赖氨酸和鼠尾胶原这两种基质对分离培养神经元的形态学研究有何影响的。资料较少。本文从分离培养交感神经元的改良Bodian 蛋白银染色背景和放射自显影术两个方面,观察和比较两种基质的影响情况,为分离培养神经元的形态学研究提供参考资料。     

人表皮扫描电镜样品的胰蛋白酶清化法

人表皮扫描电镜样品的胰蛋白酶清化法吕银慧，王仁鹏第三军医大学重庆６３００３８扫描电镜下不仅可观察样品的表面结构，亦可采用割断术来观察组织细胞内部的微细结构，对组织较深层次细胞的表面结构的扫描电镜的观察已有文献报道，本文用胰蛋白酶消化法清楚地观察到表皮...     

功能化Fe3O4的制备及在基因转染中的应用

目的探讨修饰了多聚赖氨酸的超顺磁性葡聚糖Fe3O4纳米粒子（简称功能化Fe3O4,DMNP）的制备及其作为基因载体的可行性。方法采用碱沉淀法一步合成了外包葡聚糖的磁性纳米粒子,并用多聚赖氨酸对其表面进行修饰,使之通过静电作用吸附连接DNA。同时应用扫描电镜、红外分光光度计对该纳米复合物的结构及成分进行表征,并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对其结合质粒DNA的能力进行测量．该复合纳米粒子作为基因载体将绿色荧光蛋白质粒pEGFP—C1转入人肺癌细胞系A549中,并进一步将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3．1质粒转入人肺癌细胞系A549中。结果该复合纳米粒子分散性好,大小较均一,与质粒DNA有较好的结合能力,用荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白的表达,并用PCR技术检测到了耐药基因ABCG2的表达。结论该复合纳米粒子能作为一种新型有效的基因载体在体外将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3．1质粒转入人肺癌细胞系A549中并表达。     

分离T、B细胞的新技术

淋巴细胞因免疫功能可分为T、B两型细胞,由于它们的功能与生物学研究的许多领域(免疫、癌、组织移植和血液病等)发生联系,因而,它为人们所关注。为了研究淋巴细胞亚群细胞的功能,需要分离、制备T和B细胞。依据T、B细胞的各种物理学性质(体积、密度、吸附性和表面电荷)和生物学性质(细胞膜表面的各种特异性标志),可以使用各种技术方法(物理学的和生物学的技术方法)分离、制备T、B细胞。     

大鼠侧脑室海马表面超微结构的扫描电镜观察

目的为进一步认识“脑一脑脊液神经体液回路”提供形态学资料。方法将9只大鼠灌注固定后,剥离海马并制成扫描电镜样品,在扫描电镜下观察。结果（1）大鼠海马伞的室管膜表面覆盖着大量的纤毛和微绒毛;而海马体的室管膜表面主要以微绒毛为主。（2）吞噬细胞多分布于海马伞;神经元样细胞多存在于海马体。室管膜上神经纤维可存在于海马伞的多纤毛区,也可存在于海马体的少纤毛区。结论大鼠海马表面分布有微绒毛、纤毛、室管膜上细胞和室管膜上神经纤维等结构,这些结构与室管膜细胞一起构成了“脑一脑脊液神经体液回路”的结构基础。     

大鼠脾脏的组织发生

应用光镜、扫描电镜和透射电镜对大鼠脾脏的组织发生进行了形态学观察。脾原基发生在妊娠第16天,继则血管出现,血窦形成,脾脏造血开始。妊娠第19天,网状细胞围绕着发生中的小动脉形成动脉周围鞘。随之淋巴细胞聚集于小动脉周围。出生后,各种血细胞造血相继终止,红、白髓不断发育成熟,生后第5天观察到淋巴树突细胞。边缘带、边缘窦和脾小结相继出现。生后第25天观察到原始生发中心。第40天后,脾脏各部结构基本发育完善。     

胶原-肝素自组装多层膜修饰钛表面

背景:对钛表面进行生物化修饰,改善钛表面的生物相容性是目前钛表面改性研究的热点之一。目的:采用层层自组装技术,在钛表面构建胶原-肝素多层膜,实现钛表面的细胞外基质化修饰,以改善钛的细胞相容性。方法:首先采用NaOH处理钛基材,获得多孔、负电荷的钛表面;然后吸附1层正电荷的聚赖氨酸;最后,多次交替吸附负电荷的肝素和正电荷的胶原,形成以胶原为最外层的多层膜结构。通过漫反射红外光谱、扫描电镜、原子力显微镜、接触角测量对多层膜进行表征。并与骨髓基质细胞共培养,考察细胞的黏附、增殖情况。结果与结论:漫反射红外光谱、原子力显微镜、扫描电镜、接触角测量结果表明肝素-胶原多层膜逐渐形成,此涂层可促进成骨髓基质细胞的黏附、增殖和分化。肝素-胶原多层膜有望成为一种新型的生物化钛表面,从而改善钛表面的生物相容性。