含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建

人类致龋菌变形链球菌 (Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)的一种表面蛋白ＰＡｃ ,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的重要毒力因子 ,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择ｐａｃ基因中编码ＰＡｃ主要免疫活性区域的ＤＮＡ序列 ,制备出待表达ＤＮＡ片段 ,经亚克隆至ｐＧＥＭ Ｔ质粒后 ,再克隆到高效哺乳动物表达质粒ｐＣＩ中构建成含ｐａｃ基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒 ,从而为防龋ＤＮＡ疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。一、材料和方法1.目的片段的体外扩增 :从ｐａｃ基因中选定包含两个主要免疫活性区 (Ａ区及…     

变形链球菌表面蛋白pcDNA3/pacA与pcDNA3/pacP真核表达质粒的构建

目的：构建变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ,即表面蛋白氨基端与中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个基因疫苗。方法：通过ＰＣＲ扩增,获得分别编码变形链球菌表面蛋白ＰＡｃ氨基端和中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ。将它们与真核穿梭表达载体ｐｃＤＮＡ３进行体外重组,并转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,采用菌落原位杂交筛选出阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析和ＤＮＡ序列测定。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ构建正确,目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ定向插入至真核表达载体中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别包含了变形链球菌表面蛋白ＰＡ     

变形链球菌表面蛋白PAc结构基因克隆工程数据分析

目的 使变形链球菌重要毒力因子ＰＡｃ蛋白编码基因Ｐａｃ的遗传工程背景清晰化，以利于克隆构建ＤＮＡ防龋疫苗。方法 运用ＤＮＡＳＩＳ计算机分析软件包对ｐａｃ全基因ＤＮＡ序列进行酶切图谱，开放阅读框，遗传密码子，编码蛋白等结构参数分析，并就ｐａｃ基因克隆化方案作探讨。结果 ｐａｃ基因中多个限制性内切酶切点可供制取含重要功能域的目的ＤＮＡ片段以克隆化；重要密友子及开放阅读框的阐述可帮助准确制定编码产生正确     

变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3／pacA和pcDNA3／pacP在哺乳动物细胞中

目的：研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法：利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别转染ＣＯＳ－７细胞,１ｍｇ．ｍｌ＾－１ Ｇ４１８加压筛选获取稳定转染的ＣＯＳ－７细胞之后,采用ＲＴ－ＰＣＲ法、ＬＳＡＢ法、流式细胞术及Ｗｅｓｔｅｍ印迹法,对真核表达质粒中插入基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ的转录及表达产物进行检测。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性,表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论：构建的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ和ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质,为进一步     

基因重组乳链球菌防龋疫苗免疫定菌鼠的实验研究Ⅱ:实验龋齿记分研究

目的：了解基因重组乳链球菌防龋疫苗的抗龋效果。方法：采用携带有变形链球菌表面蛋白（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ的重组乳链球菌防龋疫苗ＨＬ１０７通过灌胃、皮下注射、粘膜下注射三种途径对５０只定菌鼠进行免疫,统计龋齿记分进行比较。结果：经过重组乳链球菌免疫的大鼠口腔内龋齿记分明显低于未重组的乳链球菌ＬＭ０２３０免疫组。结论：基因重组乳链球菌能有效预防龋病的发生,可望在将来作为一种新的免疫原用于龋病的免疫学预防中。     

基因重组乳链球菌防龋疫苗免疫定菌鼠的实验研究：Ⅱ：实验龋齿记分 …

目的：了解基因重组乳链球菌防龋疫苗的抗龋效果。方法：采用携带有变形链球菌表面蛋白（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ的重组乳链球菌防龋疫苗ＨＬ１０７通过灌胃、皮下注射、粘膜下注射三种途径对５０只定菌鼠进行免疫,统计龋齿记分进行比较。结果：经过重组乳链球菌免疫的大鼠口腔内龋齿记分明显低于未重组的乳链球菌ＬＭ０２３０免疫组。结论：基因重组乳链球菌能有效预防龋病的发生,可望在将来作为一种新的免疫原用于龋病的免疫学预     

变形链球菌表面蛋白DNA防龋疫苗的构建

目的旨在构建一种新型的表面蛋白防龋疫苗—DNA防龋疫苗。方法从表面蛋白pac基因上利用BamHI和Sacl双酶切，获得一个3281bp的片段。将该片段定向插入真核表达载体PSVL，再将连接后新构成的质粒pSVL／pac转入氯化钙法制备的感受态大肠杆菌E．coliDH5a。用BamHI和SacI双酶切，琼脂糖电泳证实pSVL／pac构建的正确性。结果用定向克隆的方法获得了一个含pac基因的真核表达质粒pSVL／pac即表面蛋白DNA疫苗。结论利用定向克隆和氯化钙法可以较为简便和快速地构建表面蛋白的DNA防龋疫苗。     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究 Ⅲ．乳链球菌重组质粒DNA的Southern印迹和点印迹杂交分析

为了证实重组质粒ＤＮＡ分子中插入的外源ＤＮＡ确是来自变形链球菌拱体菌，检测受体菌中是否有探针同源的序列。本研究采用ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点印迹杂交和切口平移制备生物素ＤＮＡ探针以及光敏基因检测技术，对乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７中的重组质粒ＤＮＡｐＬＦ１０２，ｐＬＦ１０７作了进一步分析鉴定，ＤＮＡ点印迹杂交结果显示，含有ｐａｃ基因的ｐＰＣ４１ＰｓｔⅠ酶切ＤＮＡ探针均与上述质粒ＤＮＡ结合，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交提示重组质粒１．５ｋｂ的酶切片段与生物素探针杂交，证实该基因片段是从ｐＰＣ４１中获得的变形链球菌目的基因片段，重组乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７均携带变形链球菌表面蛋白抗原（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ。     

变形链球菌表面蛋白PAc防龋疫苗研究的进展

龋病是一种最常见的细菌性口腔疾病 ,免疫治疗是防治龋病的有效途径之一。基因工程疫苗和核酸疫苗因具备诸多优点而成为具有强大潜力的免疫防龋疫苗。变形链球菌是主要致龋菌 ,其细胞表面分子量为 185ｋＤ的表面蛋白抗原 (ＰＡｃ)介导了该菌对牙面的非蔗糖依赖性粘附 ,是变链菌的主要致龋毒力因子。ＰＡｃ是一种重要的候选疫苗抗原 ,具良好免疫原性 ,其全分子或部分片段进行主动或被动免疫均可有效控制变链菌在牙面的粘附 ,降低患龋率。ＰＡｃ的氨基酸序列和编码基因ｐａｃ的核苷酸序列已基本清楚 ,为ＰＡｃ基因工程疫苗和核酸疫苗的制备提…     

防龋疫苗主动免疫的现状与未来

防龋疫苗的研究已有近 40年的历史 ,多种防龋疫苗经证实确有防龋效果 ,然而防龋疫苗进入临床应用前必须解决使用安全性、防龋高效性、成本经济性等问题。近年来 ,随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展 ,从分子水平对变形链球菌(ＭｕｔａｎｓＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ,以下简称变链菌 )主要毒力因子表面蛋白抗原 (ｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ ,ＰＡｃ ,又称为抗原Ｂ、Ｉ/ＩＩ、ＩＦ、Ｐ1 )和葡糖基转移酶 (ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｅｓ,ＧＴＦｓ)的认识逐步深入 ,极大地推动了防龋疫苗的研究。国内外…     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研制 Ⅱ．变形链球菌结构基因重组质粒对乳链球菌的克隆

在获得带有结构基因的质粒ｐＰＣ４１和穿梭质粒ｐＳＡ３的基础上，制备目的基因并与载体ＤＮＡ进行体外连接，使重组体导入乳链球菌ＬＭ０２３０受体细胞，为研制防龋疫苗获得携带变链菌表面抗原基因的重组乳链球菌。     

小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆

克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。方法：设计引物，以小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库为模板，利用ＰＣＲ方法，扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段，将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ－１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ｔｕｆｔｅｌｉｎ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉丛蛋白成熟编码区基因     

表面蛋白抗原防龋疫苗研究进展

表面蛋白抗原是变形链球菌组的主要毒力因子之一，已成为防龋疫苗的主要研究对象，现将表面蛋白抗原防龋疫苗的研究进展综述如下。     

变形链球菌表面蛋白质抗原研究概况

变形链球菌细胞壁表面存在多种蛋白成分，已从变形链球菌中纯化出１０多种细胞表面蛋白质抗原，它们在防龋疫苗研究中成功地作为疫苗免疫原预防龋齿发生。本文以这类抗原Ｉ／Ⅱ、Ｂ，ＩＦ，Ｐ１，ＳＲ，ＰＡｃ的提取纯化及其在分子水平上研究状况作一概述。     

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰＰ）成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰＰ成熟区的基因片段（约３ｋｂｐ）,将所５得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA 隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨睡胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果     

基因工程重组防龋疫苗的研究进展

防龋疫苗的研究经历了三个阶段，目前国外仍将变链菌细胞表面蛋白抗原Ⅰ／Ⅱ和葡糖基转移酶蛋白抗原基因工程重组疫苗作为研究的重点。本文对基因重组防龋疫苗的研究近况进行了综述。     

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌（Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区（A－P）的序列克隆到真核载体pGLU中，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗，并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA-P质粒中A－P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21（DE3），以SDS－PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA－P的表达。通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞，以免疫组织化学检测GLUA－P的表达。结果 GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A－P片段。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P，所携带的基因序列正确，能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白。     

嵌合体防龋疫苗的研究进展

嵌合体防龋疫苗是将变链球菌的毒力因子葡糖基转移酶和表面蛋白，或分别与霍乱毒素亚单位相嵌合，依据嵌合方式不同，分化学嵌合，基因工程嵌合，直接嵌合基因免疫，对不同方式嵌合的防龋疫苗的研究，有助于比较疫苗的有效性，为免疫防龋提供理论依据。     

转基因番茄防龋疫苗的基础研究：I.变形链球菌pac基因唾液粘附区 …

目的 构建变形链球菌表面蛋白基因（ｐａｃ）唾液粘附区的植物表达质粒ｐＲＯＰ１和ｐＲＰＢ１。方法 用ＰＣＲ扩增的含变形链球菌表面蛋白唾液粘附区Ｐ１片段（１８４－１９４６ｂｐ）与植物的高效表达质粒ｐＲＯＫＣＰ结合,构建ｐＲＯＰ１表达质粒;且将此质粒与Ｂａｒ基因（抗除草剂基因）连接,构建表达质粒ｐＲＰＢ１,酶切电泳检测。结果 从ｐＰＣ４１中扩增的Ｐ１片段整合到ｐＲＯＫＣＰ的适当部位,构成重组质粒ｐＲＯＰ