人膀胱移行细胞癌EGFR基因片段与核基质蛋白的相关性

背景与目的:研究人膀胱移行细胞癌中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因片断与核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)的相关性.材料与方法:分别提取培养细胞和膀胱癌组织标本的核基质蛋白及其全细胞蛋白,同时抽提组织标本的基因组DNA和核基质DNA,根据EGFR cDNA序列合成两对PCR引物,分别以基因组DNA和各核基质DNA为模板,PCR扩增其结合片断;并对引物Ⅰ产物进行序列测定;以引物Ⅱ的产物制备探针,southwestern杂交进一步检测EGFR基因片断与核基质蛋白结合情况.结果:110 bp PCR(引物Ⅱ)产物见于基因组DNA和各核基质DNA(NM DNA 0,NM DNA25,NM DNA 50,NMDNA100);940 bp PCR(引物Ⅰ)产物出现在基因组DNA和除NM DNA100外其他核基质DNA中.940 bp序列与EGFR基因DNA序列完全一致.Southwestern blot检测结果表明,全细胞蛋白及核基质蛋白中出现特异的分子量约为60 kD的DNA-蛋白阳性杂交条带.结论:人膀胱移行细胞癌中,EGFR活性转录基因片段与核基质及核基质蛋白结合,NMPs可能和EGFR基因转录或转录后翻译等基因调控事件相关,核基质对EGFR在膀胱癌中高表达可能具有重要的调控作用.     

DNA甲基化与癌

在哺乳动物DNA中,5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosin,~mC)是唯一天然存在的修饰碱基,约占全部胞嘧啶的2～5％,这些甲基化部位的绝大部分存在于CG顺序中,按如下形式对称排列:5’-~mCG-3’ 3’-G~mC-5’,但是新复制的DNA是半甲基化(hemimethyla-tion)的,新合成链无~mG。核内DNA甲基化酶(DNA methylase)识别模板链上的甲基化部位,按照原则,在新链的相应部位进行甲基化修饰,完成~mC复制。因此,DNA甲基化类型(DNA methylation pattern)具有相对稳定的体细胞遗传性(somatically     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达

目的：克隆有特异调控活性的人ＣＤ３４基因５’端转录调控序列。方法：根据已知的ＣＤ３４抗原基因５’－端启动子调控序列,自行设计２对引物,用巢式－ＰＣＲ方法从染色体ＤＮＡ中成功的克隆６６１ｂｐ长度的ＣＤ３４抗原转录调控序列（ＣＤ３４ＴＲＳ,ＣＤ３４ＴＲＳ片段插入启动子报告质粒ｐＥＧＦＰ－１,观察重组质粒ｐＣＤ３４ＥＧＦＰ在造血系细胞和非造血系细胞中的调控表达作用。结果：经限制性内切酶酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证实,克隆的ＣＤ３４启动子序列与文献报道的顺序基本一致,能特异调探ＥＧＦＰ基因在造血细胞系细胞Ｋ５６２中表达。结论：所克隆的人ＣＤ３４分化抗原转录调控序列有特异调控真核基因表达作用,本研究为构建造血干细胞特异性表达载体奠定了基础。     

基因甲基化研究概述

表观遗传学(epigenetics)反映的主要是基因型和表型的关系。研究范围包括:DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、遗传印记、X染色体失活、RNA调控、转座元件、副突变、位置效应斑、等位反式互补等[1～5]。近年来研究较多的是胞嘧啶DNA甲基化、RNA干扰(RNAi)调控、组蛋白修饰3种,尤其是DNA甲基化。2003年欧洲HEC宣布实施人类表观基因组计划(HEP),以指导和系统地研究DNA基因甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的作用[6]。本文就现阶段对DNA甲基化研究的基本现状作一概述,以获得1个整体认识,从而在此基础上对其作进一步研究。1CpG岛DNA甲基化多发生于DNA链上胞嘧啶第5位碳原子,其与甲基共价结合,胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5mC),哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%～7%,70%～90%的5mC存在于CG二联核苷。CG在DNA中呈回文结构,通常称为CpG(p表示磷酸基),中文为磷酸胞苷酰[7]。哺乳动物中,CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%,远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中,CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上...     

应用多聚酶链反应技术早期诊断宫颈癌及尖锐湿疣的研究

1990年6月一1994年6月，对乳头状瘤病毒（HPV）感染有关的尖锐湿疣和宫颈癌的检测技术进行了研究。1．多聚酶链反应是利用了特异性DNA杂交反应原理的一种新的体外DNA扩增技术，具有敏感和特异的特点。即将含有所需放大分析的DNA双链加热变性为单链，然后加入一对与所需放大分析的DNA两端邻近顺序互补的寡聚核音酸片段作为弓I物，当引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA多聚酶和四种三磷酸脱氧核糖核耷存在下，以放大分析的DNA单链为模板，按5’－3’方向将引物延长，自动合成新的DNA链，如此反复，DNA量可成指数倍数增…     

甲胎蛋白mRNA检测方法

本文设计了两对特异性引物，用聚合酶链反应法（PCR）检测肝细胞癌病人静脉血中微量癌细胞的甲胎蛋白mRNA，PCR反应后出现与已知序列相符的101bp条带，并用Pstl限制性内切酶消化确认其特异性。该方法灵敏度达0．01fg重组DNA，在5ml静脉血中有1～10个癌细胞即可检出，且重复性好，可用于判断肝癌的早期转移。     

DNA甲基化与肿瘤

DNA的甲基化在本文中指甲基基团与基因组中 CpG二核苷酸的胞嘧啶环第 5碳原子以共价键的形式结合 , 形成 5- 甲基胞嘧啶 . 甲基化过程由 DNA甲基转移酶 (DNMT)催化 , 使用 S- 腺苷蛋氨酸作为甲基供体 . 甲基化虽然不改变核苷酸的序列 , 但和哺乳动物的基因表达调控密切相关 . 比如它能抑制转录 (详见后文 ), 并且在胚胎发育、 X- 染色体失活、基因印迹、抑制寄生 DNA序列的表达、 DNA损伤修复以及基因组稳定性等方面具有重要作用 .     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的：从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5’端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法：采用PCR法克隆NGAL基因5’端转录调控区，并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果：从SHEEC中获得了NGAL基因5’端转录调控区-1124— 65区段的克隆，该区段序列有3处点突变，在NGAL基因-1124— 65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点。结论：多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素。     

LCRG1基因5''端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚, 本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列, 寻找与其表达有关的调控序列.方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中.与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,测序正确; pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3 basic 的35倍.结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191 bp～ 585 bp),该片段具有启动子活性.     

多聚酶链反应与人类基因研究(续)

PCR(Unbalanced PCR),亦称非对称PCR(Asymmetric PCR)。 在PCR中运用2个浓度不同的引物,而使反应产物的量偏于浓度高的引物侧,通常可用于测序分析。 4.3复合PCR(Multiplex PCR)即多重PCR 在反应体系中,增加引物的组数,从而能同时扩增数个靶DNA序列,适用于基因缺失的研究。 多重PCR诊断DMD与Southern印迹同样可靠,目前多重PCR已用于检测人和仓鼠的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(8对引物)和人胆固醇硫酸酯基因位点的缺失(3对引物)。     

微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3’UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13’UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3’UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3’UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3’UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3’UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。     

c-fos反义寡核苷酸与MDR1特异Ribozyme联合对人耐药肝癌细胞株耐药性的逆转作用

多药耐药MDRl基因的过度表达是导致肿瘤细胞产生MDR的重要机制.c-fos基因表达的变化很可能对MDRl基因的表达起着调控作用.为逆转肝癌多药耐药细胞对多种化疗药物的耐受性,本文分别设计合成了针对c-fos Exonl(914-938)的25聚反义寡核苷酸(ASODN),其序列为5’CAGCGGGAGGATCACGCCTCGTAGT-3’.同时设计合成了切割MDRl mRNA第196密码子GUC序列的锤头状Ribozyme,其双链序列为:5’-pGATCCATTAATACGCTCACTATAGAATCTTCGACTGATGAG-3’,和5’-pAATTCTCTTTCA GTTTCGTC-CTCACGGACTCATCAGAATG-3’.将Ribozyme基因定向克隆于逆转录病载体pDOR-neo的BamH Ⅰ位点,经病毒包装细胞PA317包装后感染人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX,用c-fox ASODN 作用于此转化细胞株,48小时后流式细胞技术(FCM)检测联合治疗组细胞P-gp的表达为6.2～7.8%;单纯Ribozyme治疗组细胞为38～45%;对照组为93.4～97.5%.     

血浆EGFR19外显子缺失突变高灵敏度检测技术的建立

目的 探讨结合酶切及片段分析技术建立稳定的高灵敏度EGFR19外显子缺失突变检测技术检测血浆EGFR19外显子缺失突变的价值。方法 设计针对野生型片段的限制性内切酶予以降低野生型DNA背景。通过野生型和突变型序列的分析,以野生型序列为酶切底物,选择工具内切酶Tru1 Ⅰ,设计内外两个PCR反应引物,且内侧引物一端予以标记绿色荧光。采用PCR-酶切-PCR-片段分析步骤,优化各反应条件,得到稳定的技术。以野生型DNA稀释突变型DNA检测该方法的灵敏度。采用上述方法检测42例肺癌患者外周血浆中EGFR19外显子突变情况。结果 采用野生型DNA稀释突变型DNA模拟检测本方法的灵敏度,能够检测出1∶1000（Mt∶Wt） 突变型DNA。42例肺癌患者中5例血浆EGFR19外显子存在缺失,其中4例为15bp的缺失,1例为24bp的缺失。结论 本研究建立了一种联合酶切与片段分析的高灵敏度血浆EGFR 19外显子缺失突变检测技术,能够有效从外周血中检测出EGFR19外显子缺失突变。     

三氯乙烯对B6C3F1雄性小鼠肝脏和肾脏中细胞增殖相关基因表达和DNA甲基化的影响

目的:三氯乙烯(TCE)是环境中广泛存在的工业污染物,可引起小鼠肝癌,但对肾癌发生未见显著影响。本研究通过检测TCE对小鼠肝脏和肾脏细胞增殖和DNA甲基化调控相关基因表达以及对DNA甲基化的影响,探讨TCE引起小鼠肝癌的分子机制。方法:将6周龄B6C3F1雄性小鼠随机分成3组,每组4只,分别以0、500和1 000 mg/kg剂量的TCE连续灌胃5 d。以荧光定量PCR方法检测TCE染毒小鼠肝脏、肾脏中与细胞增殖以及DNA甲基化调控相关基因的mRNA表达水平,以结合重亚硫酸盐的限制性内切酶方法检测Cdkn1a启动子区和重复序列的DNA甲基化水平。结果:与对照组相比,TCE可引起小鼠肝脏中细胞增殖相关基因Cdkn1a、Jun和Mki67的mRNA水平显著升高(P均<0.05),且呈剂量反应关系。同时1 000 mg/kg TCE染毒小鼠肝脏中主要DNA甲基化调控基因Dnmt3a、Dnmt3b和Tet2的mRNA水平降低(P均<0.05),Uhrf1 mRNA的表达升高(P均<0.05)。TCE染毒还导致肝脏内Cdkn1a启动子区的DNA甲基化水平降低,但对肾脏中相关基因及DNA甲基化水平无显著影响。结论:TCE引起的细胞增殖相关基因表达升高及DNA甲基化异常可能在其促进小鼠肝癌发生中起重要作用。     

DNA甲基化与大肠癌发生的研究进展

DNA甲基化由于影响基因突变、基因表达调控、基因组稳定性等方面 ,因此在肿瘤的发生和演进过程中扮演着一定的角色。近来 ,DNA甲基化机制及其与大肠癌发生关系的研究进展很快 ,现对最近 3年这方面的进展作一简要介绍。1　 DNA甲基化的概念DNA甲基化主要指在胞嘧啶的 5位碳上加上一个甲基基团 ,该反应由 S-腺苷蛋氨酸 (SAM)提供甲基 ,由 DNA甲基转移酶 (DMT)催化 ,形成 5甲基胞嘧啶 (5 m C)。 5 m C是真核细胞中唯一天然存在的修饰碱基 ,约占整个胞嘧啶的 3% ,而 90 %的 5 m C存在于 Cp G序列中。哺乳动物 DNA中 5 0 %～ 90 %的…     

端粒酶逆转录酶(hTERT)在肿瘤诊治中的应用

端粒酶(Telomerase)是一种多成分组成的核酸蛋白酶.1985年,最早在纤毛四膜虫中被发现,1989年首次在人HeLa细胞株中被分离[1].端粒酶又称端粒特异性末端转移酶,它能以端粒DNA的3端为引物、以自身RNA部分为模板、特异性地把端粒DNA的重复序列(TTAGGG)加到染色体末端,以补偿DNA不完全复制造成的端粒缩短,从而达到维持端粒长度和染色体稳定的功能.     

双链DNA直接测序法在环境诱变剂致突变分子机制研究中的应用Ⅰ.非突变质粒抗性基因片段的序列测定

本文报告了双链DNA直接测序法的建立,并以质粒pBR322为研究对象,选择其四环素抗性基因作为模板,合成了一个位于E.coRI位点逆时针方向紧邻处的寡核苷酸5′-GGCCCTTTCGTCTTC-3′作为引物。整个测序主要步骤包括:双链DNA碱变性、酶促合成反应和双脱氧末端终止法。结果显示,在非梯度胶的情况下,可以清晰可靠地读出200多个核苷酸顺序。     

PCR的最新进展

1985年建立的PCR技术改变了在基础、临床实验室中研究DNA的方法。变性、退火、延伸三个步骤为一个循环,三十个循环就可使特定的DNA片段在聚合酶作用下扩增几百万倍。产物是以指数形式累积,因为每次循环的产物便是下一次循环的模板,即使新链合成不完全,仅有一个引物结合点,它也能参与下一循环。产物总长为两引物长加引物夹持的DNA的长度。PCR可扩增双链DNA、单链DNA、RNA,并能将RNA反转录成cDNA再加扩增。此外,尚可通过引物带入各种标记或新的序列,如特异突变、内切酶位点、调控因子等。在此,我们就PCR最