hTNF—α单克隆抗体轻, 链可变区基因的克隆和序列及分子结…

从两株具肮亲和力及中和活性的抗人肿瘤坯死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基     

鼠抗hTNF－α单克隆抗体轻链可变区基因片段的克隆和cDNA序列测定

目的：获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单克隆抗体轻链可变区基因序列。方法：采用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以一对针对鼠Ｉｇ轻链可变区（ＶＬ）基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中扩增和克隆ＶＬ基因片段，用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，并进行计算机分析。结果：此ＶＬ基因长３４２ｂＰ，可编码１１４个氨基酸，为开放读框；有明确的框架区（ＦＲＳ）和抗原互补决定区（ＣＤＲＳ）；含有抗体可变区特征性的两个半胱酸残基。在基因数据库（ＥＭＢＬＧｅｎｅＢａｎｋ１９９５）中，未查见相同序列的基因。结论：此ＶＬ基因系重排的鼠Ｉｇ轻链基因。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

鼠抗hTNF—α单克隆抗体轻链可变区基因片段的克隆和cDNA…

目的：获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单克隆抗体轻链可变区基因序列。方法：采用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以一对针对鼠Ｉｇ轻链可变区（ＶＬ）基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中扩增和克隆ＶＬ基因片段，用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，并进行计算机分析。结果：此ＶＬ基因长３４２ｂｐ，可编码１１４个氨基酸，为开放读框；有明确的框架区（ＦＲｓ）和抗原互补决定区     

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。     

抗人Lp(a)单链抗体基因的构建及序列测定

目的 构建鼠抗人脂蛋白（Ｌｐ）（ａ）单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法 在从分泌高亲和力的抗人Ｌｐ（ａ）单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取细胞的总ＲＮＡ，以随机引物反转录合成ｃＤＮＡ，以特异引物进行ＰＣＲ，扩增单抗的ＶＨ和ＶＬ基因。采用限制性内切酶酶切拼接法，并按ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ的结构，将ＶＬ和ＶＨ基因拼接成单链抗体基因，并进行序列分析。结果 拼接成的ＳｃＦｖ基因长度约为７３０ｂｐ。结论 所构建的     

鼠抗hTNF—α单克隆抗体重链基因片段的克隆和cDNA序列测定

采用反转录ＰＣＲ方法，以一对锚ＰＣＲ引物和一对针对鼠ＩｇＶＨ区基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中，分别扩增和克隆了自５′非翻译区至Ｃγ１近３′端的重链基因片段和重链可变区基因片段，并测定了其核苷酸序列。计算机分析表明，系重排的鼠Ｉｇ重链基因。     

抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定

目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ,ＶＨ）,在大肠杆菌中表达Ｆａｂ段核实其功能活性。结果分别得到了２个Ｖκ和２个ＶＨ基因。ＤＮＡ序列测定表明,其中１个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因。１个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性。另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Ｖκ、ＶＨ序列相符。将该轻链、重链基因分别克隆到了人－鼠嵌合轻链、重链表达载体中。结论通过原核表达系统核实,获得了抗ＴＮＦ－α单抗的可变区基因     

抗CD8单抗轻,重链可变区基因的克隆和序列分析

采用反转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法，从分泌特异性抗ＣＤ８单抗的杂交瘤细胞中扩增出该抗体轻，重链可变区（ＶＨ，ＶＬ）基因，并测定了其序列，经计算机分析，ＶＨ和ＶＬ基因均为新发现的基因序列，符合功能重排的鼠抗体可变区基因特征。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

抗乙酰胆碱受体α－银环蛇毒素结合区抗体可变区的序列分析

通过对３株抗乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）的α－银环蛇毒素（α－ＢＴ）结合区抗体的配位特异性测定和可变区基因序列分析，探讨重症肌无力（ＭＧ）的发病机制。这３株抗体相互竞争对ＡＣｈＲ的结合，说明它们具有共同的识别部位。３株抗体的Ｈ链可能来源于同─种系基因，并且在抗原亲和成熟过程中发生体细胞突变；Ｌ链则由不同的亚组基因编码。结果表明，抗ＡＣｈＲα－ＢＴ结合区抗体的Ｈ链在决定抗体配位特异性上起重要作用。     

抗胃癌鼠单抗3G9 Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌…

本文报道用聚合酶链延伸反应（ＰＣＲ）从分泌抗胃癌鼠单抗的杂交瘤细胞系３Ｇ９中克隆出了重链Ｆｄ段和ｋ链的基因。ＤＮＡ序列测定表明３Ｇ９的ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ７１８３、ＤＦＬ１６．１和ＪＨ３；Ｖｋ和Ｊｋ分别属于ＶｋⅡ和Ｊｋ２。将３Ｇ９Ｆｄ段和ｋ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３中，在大肠杆菌中获得了表达，用还原和非还原的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳作免疫印迹实验，证明了Ｆａｂ段的表达。并用酶联免过滤实     

CLONING AND SEQUENCE CHARACTERIZATION OF THE RE-ARRANDED VH GENE FROM HYBRIDOMA CELLS SECRETING ANTI-HUMAN C1-INHIBITOR McAb

由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，合成与ＶＨ基因ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，以ＲＮＡ反转录合成的第一链ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法克隆出Ｆ７ＶＨ基因的ＤＮＡ片段。将分离获得的目的ＤＮＡ片段亚克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两头进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＨ基因是由３３３个碱基组成，编码１１１个氨基酸残基。通过国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现，Ｆ７ＶＨＤＮＡ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因特征；同源性为６０％～８５％，应归属于Ｉｇ的ＶＨ基因。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＨ基因推导的氨基酸顺序属于小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因的Ⅱ（Ａ）亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３重排产生；其框架区的９和６７位点为脯氨酸（Ｐｒｏ）和赖氨酸（Ｌｙｓ）（非芳香族氨氨酸），符合Ⅱ（Ａ）亚组框架残基结构模式；其ＣＤＲ３区含有７个氨氨酸残基，表明Ｃ１－ＩＮＨ抗原表面结构并不复杂；ＦＲ２和ＦＲ３的２２和８９位点为半胱氨酸残基（Ｃｙｓ），与ＶＨ片段二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＨ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下良好的基础。     

出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的构建

以３种方法从出血热恢复期患者外周血淋巴细胞成功地扩增出人抗体Ｖ区３种基因片段（ＶＨ，Ｖ，Ｖλ），通过桥拼接延伸反应（ＳＯＥ），以（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３为连接子，将重、轻链Ｖ区基因连接成为ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｉｃ和ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖλ两种单链抗体基因。然后将ＳｃＦｖ基因与载体ｐＨＥＮ１重组，转染感染受态大肠杆菌ＴＧ１，通过辅助噬菌体Ｍ１３ＫＯ７的超感染，制备成两种“噬菌体展示人源性全套ＳｃＦｖ抗     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

选用具有动物体内高保护作用的抗ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性糖蛋白Ｃ（ｇＣ）单克隆抗体１Ａ１２，从其杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物反转录合成ｃＤＮＡ，用一对鼠抗体通用ＶＨ引物和一对Ｖ引物进行ＰＣＲ，扩增出１Ａ１２ＶＨ和１Ａ１２ＶＬ基因，并分别克隆入ｐＵＣ１８质粒中，序列分析结果表明，１Ａ１２ＶＨ基因由３３６ｂｐ组成，编码１１２个氨基酸，隶属于小鼠重链第３组亚组（Ｄ）；１Ａ     

9.1C3单克隆抗体轻,重链可变区基因克隆及序列分析

９．１Ｃ３分子是一种参与ＮＫ、巨噬细胞及ＬＡＫ细胞杀伤过程的重要细胞表面分子，主要表达于外周血单个核细胞表面。本文运用分子生物学技术，从分泌９．１Ｃ３ＭＣＡｂ的杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，经反转录、ＰＣＲ分另１１分离了９．１Ｃ３ＭｃＡｂ轻链可变区（ＶＬ）基因及重链可变区（ＶＨ）基因，并用全自动荧光ＤＮＡ序列分析仪对９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ基因序列进行了分析。结果表明：９．１Ｃ３ＶＨ基因为３５１ｂＰ，编码１１７ａａ残基，９．１３ＶＬ为３２４ｂＰ，编码１０８ａａ残基；从推导出的氨基酸序列分析证实９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ序列均符合小鼠ｌｇ可变区的氨基酸序列特征；根据Ｋａｂｂａｔ分类体系，９．１Ｃ３ＶＨ隶属Ｉｇ重链第Ⅱ（Ｃ）亚组，９．１Ｃ３ＶＬ隶属小鼠ＩｇＫ链第Ⅴ亚组。９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ基因的克隆成功为其单链抗体的构建、表达奠定了良好的物质基础。     

抗原表位定向选择的人源抗TNF-αFab的鉴定

目的对通过抗原表位定向选择技术（ＥＧＳ）所筛选到的２株人源化ＴＮＦ－α抗体Ｆａｂ段进行分析鉴定。方法测定可变区基因的序列,用亲本鼠单抗Ｚ８进行竞争ＥＬＩＳＡ,用Ｌ９２９细胞检测其体外中和ＴＮＦ－α的活性,并用硫氰酸铵洗脱法比较与亲本鼠单抗的亲和力。结果基因测序表明２株抗体ＶＨ相同,属人ＶＨⅠ亚群;Ｖκ分别属人ＶκⅠ、ＶκⅢ亚群;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源抗体是针对ＴＮＦ－α的同一抗原表位;体外中和实验证明此抗体片段能中和ＴＮＦ－α对Ｌ９２９细胞的毒性;该抗体片段的亲和力略低于原鼠单抗Ｚ８。结论用ＥＧＳ方法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠单克隆抗体Ｚ８的特性     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素mAb V_H和V_L基因的克隆与序列测定

用提取的Ａ 型产气荚膜梭菌α毒素包涵体为免疫原, 制备了１ 株ｍＡｂ ２Ｅ３ 。其Ｉｇ 亚类为ＩｇＧ３, 细胞培养上清和腹水的ｍＡｂ 效价分别为１∶１０２４ 和１∶１０８ 。该ｍＡｂ ２Ｅ３ 可中和α毒素的磷脂酶Ｃ 活性和溶血活性, 对α毒素致死性腹腔攻击的小鼠具有良好的被动保护作用。另外, 应用ＲＴＰＣＲ 技术, 从杂交瘤细胞株２Ｅ３ 中, 扩增出ｍＡｂ ＶＨ 和ＶＬ基因, 分别克隆至载体ｐＧＥＭＴ中。序列分析证实, ＶＨ 基因为３５７ ｂｐ, 编码１１９ 个氨基酸;ＶＬ 基因为３２４ ｂｐ, 编码１０８ 个氨基酸。计算机分析表明,ＶＨ 和ＶＬ基因均为新发现的基因序列, 符合功能性重排的鼠抗体可变区基因的特征。ＶＨ 和ＶＬ 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（ Ｂ） 和轻链κⅢ家族。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的：构建抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ片段表达载体,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。结果：利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０单链抗体（ＳｃＦｖ）表达载体上扩增抗ＣＤ２０抗体轻链可变区基因（ＶＬ）、重链可变区基因（ＶＨ）,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ中,构建抗ＣＤ２０Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ１ｃｄ２０,并在２７Ｃ７菌中高效表达。结果：经Ｆａｂ表达载体转化的２７Ｃ７菌株,进行表达培养,经分     

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ抗体的轻链和重链Ｆｄ段基因,分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＬＰＴＧ诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处３有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为５３％和４８。Ｌ链和Ｆｄ包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中,Ｌ和Ｆｄ可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。