姜黄素对放线菌素D/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究

目的:观察中药单体姜黄素对ActD/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法:采用MTT法确定实验药物的最佳浓度;Hoechst33258荧光染色法观察PC12细胞的凋亡;JC-1荧光分子探针检测线粒体膜电位;Real Time PCR检测凋亡基因Bcl-2/Bax的表达。结果:ActD/TNF-α协同作用可导致PC12细胞的活力降低(P<0.05);出现核固缩、核碎裂现象的细胞增多,细胞凋亡率增高(P<0.05);细胞线粒体膜电位下降;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达降低(P<0.05)。经姜黄素(5μmol/L)处理后,PC12细胞的活力增强(P<0.05);细胞核固缩、核碎裂现象减少,细胞凋亡率下降(P<0.05);细胞线粒体膜电位上升;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达增强(P<0.05)。结论:姜黄素可拮抗ActD/TNF-α引起的PC12细胞凋亡,可能与升高线粒体膜电位,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。     

红藻氨酸诱导PC12细胞凋亡及阿魏酸对神经元的保护作用

 目的： 探讨阿魏酸(ferulic acid, FA)对红藻氨酸(kainic acid, KA)诱导的PC12细胞凋亡的作用及其机制。方法：采用50 μmol/L KA诱导PC12细胞凋亡建立阿尔茨海默病神经细胞模型,然后将处理后的PC12细胞分为KA模型组和KA＋FA (25、50和100 μmol/L)处理的低、中、高剂量组,同时设立正常对照组。采用MTT比色法检测PC12细胞的存活率;采用免疫细胞化学法观察PC12细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax和细胞色素C (Cyt C)的表达;annexin Ⅴ+PI双染流式细胞术检测PC12的细胞凋亡率;蛋白免疫印记技术检测PC12细胞中Bcl-2、Bax和Cyt C的表达水平。结果：MTT法和免疫细胞化学检测显示,与正常组相比,模型组PC12细胞的存活率明显下降,且细胞中Bcl-2表达减少(P<0.01),而Bax和Cyt C表达升高,Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01),流式细胞术检测细胞的凋亡率显示,模型组细胞的凋亡率显著上升(P<0.01)。蛋白印迹术检测显示,模型组细胞中Bcl-2表达量减少,Bax和Cyt C表达量升高,与正常组比较差异显著(均P<0.01)。当采用FA干预后,与模型组相比,25、50和100 μmol/L组细胞的存活率明显上升,细胞凋亡率减少,而且能增加Bcl-2阳性百分率和表达水平,明显减少Bax和Cyt C阳性百分率和表达水平,使Bcl-2/Bax比值增加 (P<0.05或P<0.01)。结论：KA在50 μmol/L时可明显诱导PC12发生凋亡,FA在25～100 μmol/L时能显著抑制KA诱导的PC12细胞凋亡,其神经保护机制可能是通过抑制Bax和Cyt C的表达,升高Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值,从而阻断内源性细胞凋亡通路而提高神经细胞的存活率。     

PXD101诱导人前列腺癌细胞PC3凋亡的线粒体信号通路

目的:探讨PXD101(又称belinostat)诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的线粒体通路。方法:PXD101以不同刺激时间和剂量处理PC3细胞,CCK-8法检测细胞的活力;流式细胞术检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位;Western blot检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)和Bax;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。结果:PXD101能以时间和剂量依赖的方式抑制PC3细胞的存活(P0.05),流式细胞术检测结果表明PXD101处理后PC3细胞的凋亡率明显增加(P0.01)。PXD101能时间依赖性致线粒体膜电位降低和Bcl-2蛋白含量明显下降,Bax蛋白含量上升,促进线粒体释放Cyt C蛋白,caspase-3活性明显增强。结论:PXD101通过线粒体途径诱导人前列腺癌细胞系PC3细胞凋亡。     

敲减G蛋白偶联受体75表达抑制20-HETE诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的:探讨G蛋白偶联受体75(GPR75)对20-羟二十烷四烯酸(20-HETE)诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及机制。方法:慢病毒转染敲减H9c2心肌细胞GPR75基因表达;TUNEL法检测细胞凋亡率;RT-qPCR法检测GPR75以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的mRNA表达;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位水平;Western blot法检测GPR75、Bcl-2、Bax及细胞色素C(CytC)蛋白表达;发色底物法检测caspase-3的活性。结果:H9c2心肌细胞在mRNA及蛋白水平均表达GPR75,敲减GPR75抑制了20-HETE诱导的细胞凋亡(P<0.05);同时,敲减GPR75阻断了20-HETE诱导的Bax和CytC表达上调以及caspase-3活性增高作用(P<0.05),逆转了20-HETE诱导的Bcl-2表达下调和线粒体膜电位下降(P<0.05)。结论:20-HETE通过GPR75介导引起线粒体功能紊乱,诱导H9c2心肌细胞凋亡。     

沉默Apaf-1 基因对氧糖剥夺/ 复氧复糖PC12 细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Apaf-1基因对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。方法:PC12细胞随机分为3组:正常组(Control)、模型组(Model)、Apaf-1基因沉默组(Apaf-1-siRNA)。正常组于CO2培养箱内正常培养,其余2组给予氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h处理,Apaf-1-siRNA组于造模前将化学合成的siRNA通过脂质体转染于PC12细胞靶向沉默Apaf-1基因。用荧光标记的siRNA检测Apaf-1转染效率,Western blot检测转染后PC12细胞Apaf-1蛋白表达,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测Bax/Bcl-2比值,Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达。结果:Apaf-1-siRNA可有效沉默PC12细胞Apaf-1蛋白表达(P<0.05)。与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与Model组相比,Apaf-1-siRNA组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05),Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:靶向沉默Apaf-1基因可有效降低氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率。     

亚硒酸钠通过线粒体途径诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制

目的通过检测亚硒酸钠诱导人胃癌SGC-7901细胞系凋亡过程中Bax/Bcl-2、线粒体膜电位和细胞色素C(Cyt C)表达的变化,探讨亚硒酸钠诱导胃癌细胞凋亡的作用机制。方法将人胃癌细胞系SGC-7901细胞加入不同浓度亚硒酸钠(2.5、5.0、10.0mol/L)的培养液中培养24h、48h,免疫细胞化学法和免疫印迹法(Western blotting)检测Bax/Bcl-2蛋白的表达;以罗丹明123(rhodamine123)为细胞染色剂,采用流式细胞技术检测细胞的线粒体膜电位的变化;Western blotting检测细胞质Cyt C和线粒体Cyt C蛋白含量的变化。结果免疫细胞化学法和Western blotting检测结果显示,亚硒酸钠能够能够提高Bax蛋白的表达(P0.05)、降低Bcl-2蛋白的表达(P0.05),且呈剂量依懒性;流式细胞术结果显示,亚硒酸钠能够降低细胞线粒体膜电位;提示:亚硒酸钠可以通过改变Bax、Bcl-2蛋白的含量,降低线粒体的膜电位来诱导细胞凋亡。Western blotting检测结果显示,亚硒酸钠能够提高细胞质Cyt C蛋白的表达(P0.05)并降低线粒体内Cyt C蛋白的表达(P0.05),促使线粒体内的Cyt C向细胞质内释放。结论亚硒酸钠通过上调Bax并下调Bcl-2蛋白表达,降低线粒体膜电位,促进Cyt C从线粒体释放到细胞质,通过线粒体途径诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。     

线粒体凋亡途径在槲皮素诱导U937 细胞凋亡中的作用研究

目的:观察槲皮素对人急性髓系白血病U937 细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位(Δφm),、人B 细胞淋巴瘤因子- 2、人Bcl-2 相关X 蛋白、细胞色素c 表达及半胱氨酸蛋白酶鄄3、半胱氨酸蛋白酶鄄9 活性的影响,探讨线粒体凋亡途径在槲皮素 诱导U937 细胞凋亡中的作用。方法:体外培养U937 细胞,分别以0、10、20、40、80、160μmol/ L 浓度的槲皮素处理24、48 和 72 h,采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8) 检测槲皮素对U937 细胞增殖的抑制作用;实验随机分为对照组 (Control)、槲皮素10、20 组和40 μmol/ L 组。采用流式细胞仪AnnexinV-FITC/ PI 双染法检测U937 细胞凋亡情况;采用荧光染 料3,3‘-二己基含氧碳菁碘代物[3,3‘-dihexyloxacarbocyanine iodide,DiOC6(3)]染色,流式细胞仪检测U937 细胞的变化; 采用Western blot 检测U937 细胞Bcl-2、Bax、Cytc 表达;采用比色法检测U937 细胞Caspase-3、Caspase-9 活性。结果:槲皮素可 抑制U937 细胞的增殖,抑制率显著升高,且呈时间-剂量依赖性。槲皮素亦可显著抑制U937 细胞凋亡率,与对照组比较(P< 0.01)。槲皮素显著降低U937 细胞驻鬃m,与对照组比较(P<0.01)。槲皮素显著下调U937 细胞Bcl-2 表达,上调Bax 表达,下 调Bcl鄄2/ Bax 比值及上调Cyt c 表达,与对照组比较(P<0.01)。槲皮素显著升高U937 细胞Caspase-3、Caspase-9 活性,与对照 组比较(P<0.01)。结论:槲皮素可显著抑制U937 细胞增殖,线粒体凋亡途径激活是槲皮素诱导U937 细胞凋亡的途径之一。     

转染miR-17-5p对PC12细胞Bcl-2、Bax蛋白表达和形态学影响

目的:观察基因miR-17-5p转染对PC12细胞Bcl-2、Bax蛋白表达和形态学影响。方法:用质粒PEGFP-N1-vector空载体和PEGFP-N1-miR-17-5p表达载体转染正常的PC12细胞,将细胞分为对照组、空载组、miR-17-5p组。应用免疫细胞化学染色法和Western-blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,电镜观察各组细胞超微结构改变。结果:对照组与空载组Bcl-2、Bax蛋白表达无显著性差异,miR-17-5p组与空载组比较,Bcl-2蛋白表达明显减少(P0.01),而Bax蛋白表达明显增多(P0.01),Western blot检测其凋亡相关蛋白表达变化与免疫组化结果一致。电镜下观察可见正常对照组与空载组细胞形态无明显差异,细胞形态结构正常,无明显病理改变;miR-17-5p转染组细胞胞体肿胀,线粒体髓样变和空泡样变,胞核扭曲凹陷,异染色质边集。结论:miR-17-5p基因过表达能引起PC12细胞促凋亡的Bax蛋白表达增多,抗凋亡的Bcl-2蛋白表达减少,导致PC12细胞形态学损伤。     

CEPO对6-OHDA诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导PC12细胞损伤及凋亡的保护作用及其可能机制。方法借助CCK8、流式细胞(Flow cytometry,FCM)、Western-blotting和逆转录PCR(RT-PCR)技术检测PC12模型细胞相关指标的变化,实验数据以SPSS15软件统计分析。结果 CCK8结果显示6-O-HDA处理能够显著降低PC12模型细胞的存活率,而CEPO处理对其变化显示抑制作用;FCM技术探察结果显示,6-OHDA处理能够明显诱导PC12模型细胞的损伤与凋亡,而CEPO预处理能够减轻PC12模型细胞的损伤与凋亡(P<0.05);借助Western-blotting技术探察显示6-OHDA+CEPO处理组的PC12细胞的Cleaved caspase-3蛋白表达量显著低于6-OHDA处理组(P<0.05);RT-PCR结果显示,6-OHDA处理明显降低PC12模型细胞的Bcl-2 mRNA的表达(P<0.05)以及上调PC12模型细胞的Bax mRNA的表达(P<0.01),而CEPO处理明显上调Bcl-2 mRNA的表达水平(P<0.05)以及抑制Bax mRNA的表达(P<0.05)。结论CEPO处理能够显著抑制6-OHDA所诱导的PC12细胞的损伤及凋亡,其作用机制可能与其上调Bcl-2,并下调Bax和Caspase-3的表达有关。     

BARF1表达下调通过活化caspase依赖的线粒体通路诱导EBV阳性胃癌细胞凋亡

目的:研究BARF1表达下调对EBV阳性胃癌细胞凋亡的影响,以及BARF1基因沉默介导细胞凋亡的分子机制。方法:siRNA和NCsiRNA分别转染NUGC3和SNU719细胞,运用Western blot测定细胞中BARF1、Bcl-2、Bax、细胞色素C、caspase 3和caspase 9的蛋白表达;RT-PCR测定BARF1、Bcl-2和Bax mRNA的表达;台盼蓝染色法测定细胞存活率;Annexin V-FITC/PI染色法和流式细胞仪测定细胞凋亡;细胞凋亡因子抗体芯片分析细胞中凋亡相关蛋白的表达;线粒体膜电位检测试剂盒测定线粒体膜电位;免疫共沉淀检测细胞中Apaf-1和caspase 9的相互作用。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,BARF1基因沉默显著诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡,而线粒体膜电位显著降低。BARF1沉默基因能促进促凋亡蛋白的表达并抑制抗凋亡蛋白的表达,Bcl-2/Bax比例显著降低;而caspase抑制剂能抑制由BARF1基因沉默介导的细胞凋亡。在siRNA转染的细胞中,caspase 3和caspase 9蛋白发生裂解,细胞色素C的浓度显著高于阴性对照组,Apaf-1蛋白与caspase 9蛋白在细胞质中能够发生相互作用。结论:BARF1基因沉默通过线粒体途径调节Bcl-2和Bax蛋白的表达进而诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡,并呈caspase通路依赖关系。     

毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

目的 探讨毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。 方法 将PC12细胞随机分为4组：正常组（control）、模型组（model）、毛蕊异黄酮组（calycosin）和尼莫地平组（nimodipine,阳性对照药组）。除control组外,其余各组进行缺氧缺糖2 h,复氧复糖24 h制作模型处理。Calycosin组和nimodipine组在复氧复糖的同时分别给予含有毛蕊异黄酮（0.07 μmol/L）和尼莫地平（5.00 μmol/L）的含药培养基处理。用CCK-8法检测各组细胞活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞免疫荧光法检测各组细胞Bax/Bcl-2比值,Western blotting法检测线粒体凋亡通路中关键蛋白细胞色素C（Cyt-C）、凋亡酶激活因子1（Apaf-1）和Caspase-3表达。 结果 与control组相比,model组细胞的活性明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值明显升高（P<0.05）,线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3的表达均明显升高（P<0.05）;与model组相比,calycosin组和nimodipine组的细胞活性均明显提高（P<0.05）,细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值明显降低（P<0.05）,线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3的表达均明显降低（P<0.05）,差异有统计学意义。 结论 毛蕊异黄酮可显著提高缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞活性,抑制细胞凋亡,其作用机制与毛蕊异黄酮抑制线粒体凋亡通路中关键蛋白Cyt-C、Apaf-1和Caspase-3表达密切相关。     

α7烟碱样乙酰胆碱受体拮抗剂减轻淀粉样β蛋白诱导的PC12细胞损伤的机制研究

目的: 探讨长时间应用α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7 nAchR)拮抗剂对淀粉样β蛋白(Aβ)处理的PC12细胞的影响及其作用机制。方法: 采用高分化的PC12细胞作为研究对象,用Aβ_25-35复制细胞损伤模型;以α7 nAchR拮抗剂(甲基牛扁亭碱,methyllycaconitine)和nAchR激动剂(尼古丁,nicotine)预处理PC12细胞。实验分4组:空白对照组、Aβ_25-35组、尼古丁+ Aβ_25-35组和甲基牛扁亭碱+ Aβ_25-35组。用JC-1荧光分子探针通过线粒体膜电位检测PC12细胞的凋亡,用Western blotting检测α7 nAChR和凋亡调节蛋白(Bcl-2/Bax)的表达。结果: 在药物作用36 h后,与空白对照组比较,Aβ_25-35组的凋亡率增高,Bcl-2/Bax和Bax的表达无明显差异,α7 nAChR表达增加;与Aβ_25-35组比较,尼古丁+ Aβ_25-35组细胞凋亡率降低,但是Bcl-2/Bax表达也无明显差异,而α7 nAChR和Bax表达均降低;与Aβ_25-35组比较,甲基牛扁亭碱+ Aβ_25-35组凋亡率虽然无明显差异,但是Bcl-2/Bax表达显著升高,同时α7 nAChR和Bax表达均明显降低;与尼古丁+ Aβ_25-35组比较,此时甲基牛扁亭碱+ Aβ_25-35组的凋亡率较高,Bcl-2/Bax显著升高,α7 nAChR和Bax表达均显著降低;除空白对照组外,α7 nAChR和Bax表达呈明显正相关。在药物作用84 h后,与空白对照组比较,Aβ_25-35组的凋亡率仍然是增高的,Bcl-2/Bax表达仍然无明显差异,α7 nAChR表达降低,Bax表达明显增高;与Aβ_25-35组比较,尼古丁+ Aβ_25-35组细胞凋亡率和Bcl-2/Bax表达无明显差异,α7 nAChR和Bax表达仍然较低;与Aβ_25-35组比较,甲基牛扁亭碱+ Aβ_25-35组凋亡率有所降低,而且Bcl-2/Bax表达仍然显著升高,α7 nAChR和Bax表达仍然明显降低;与尼古丁+ Aβ_25-35组比较,甲基牛扁亭碱+ Aβ_25-35组的凋亡率较低,Bcl-2/Bax仍然显著升高,α7nAChR和Bax表达仍然显著降低;除空白对照组外,α7 nAChR和Bax表达呈明显正相关。结论: 随着作用时间的延长,尼古丁的保护作用逐渐消失,而甲基牛扁亭碱的保护作用逐渐显现。甲基牛扁亭碱可能是通过下调α7 nAChR并阻断Aβ_25-35的损伤作用,显著持续升高Bcl-2/Bax,从而可能产生抑制细胞凋亡的作用。所以,nAcR激动剂也许并不适合长时间治疗阿尔茨海默病,而拮抗剂可能会为治疗提供一个新的方向。     

碱性成纤维细胞生长因子对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的抑制作用

目的:利用体外培养的PC12表现出神经细胞的特性,用Aβ_25-35诱导PC12细胞凋亡,建立神经细胞毒性作用的模型,来探索bFGF对Aβ_25-35作用和治疗老年性痴呆(AD)的机制。方法:通过Giema's、PI染色法、DNA琼脂糖凝胶电泳、Westernblot及流式细胞仪研究了加入Aβ_25-35培养的以及Aβ_25-35和bFGF共培养的PC12细胞的形态和分子生物学改变及凋亡相关基因Bcl-2,Bax表达的变化。结果:Aβ_25-35可诱导PC12细胞核DNA发生降解,出现染色质浓缩成块状、胞浆浓缩、胞膜内陷、凋亡小体形成等;而Aβ_25-35和bFGF共培养的PC12细胞则能缓解这种形态学上的变化,细胞凋亡率减少,Bcl-2的表达量上调而Bax的表达量下调。结论:bFGF能抑制Aβ_25-35对神经细胞的毒性作用,其机制可能是通过调控Bcl-2、Bax的表达来实现的。