周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究

目的探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白（F-actin）的相互关系。方法对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2 000 μstrain,按3、6、12 h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测c-fos mRNA的变化,筛选最佳加载时间点,并作为实验组和0 h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化。结果周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3 h达到峰值;在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化;经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制。结论周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin。F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节。     

神经生长因子调控降钙素基因相关肽的表达及对MG-63细胞增殖的影响

目的 探讨创伤愈合过程中神经生长因子（NGF）调控降钙素基因相关肽（CGRP）的表达,以及影响MG-63细胞增殖的作用机制。方法 加入不同质量浓度的NGF刺激MG-63细胞,1、2、3、4 d后收集样本,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测CGRP的表达,实时荧光定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测CGRP mRNA的表达,采用细胞计数法（CCK-8）检测MG-63细胞的增殖;在MG-63细胞中加入NGF受体阻断剂,采用RT-QPCR和CCK-8检测CGRP mRNA的表达及MG-63细胞的增殖效率。结果 在NGF作用下,MG-63细胞分泌的CGRP表达量明显上调,随NGF质量浓度升高,CGRP表达量也相应升高,具有浓度依赖性,CGRP表达量随NGF作用时间延长也相应增加（P<0.05）;随NGF质量浓度升高和作用时间延长,MG-63细胞的增殖效率也相应增加（P<0.05）。加入NGF受体阻断剂后此作用相应减弱（P<0.05）。结论 在创伤愈合过程中NGF能通过上调CGRP的表达量影响MG-63细胞的增殖,从而促进创伤愈合。     

灯盏花联合机械牵张力对成骨细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的：研究灯盏花、机械牵张力以及灯盏花与机械牵张力联合作用下对体外培养的成骨细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响,探讨灯盏花对正畸骨改建的作用机理。方法：体外培养成骨样细胞株MG63细胞,细胞的机械牵张力刺激采用SXG4201型四点弯曲细胞力学加载仪。分别单用机械牵张力刺激（2000 μstrain,0.5Hz）、单用灯盏花（1mg/mL）干预、以及机械牵张力（2000 μstrain,0.5Hz）和灯盏花（1mg/mL）联合干预MG63细胞不同时间（3h,6h,12h,24h）后,提取细胞总RNA和蛋白质,用Western blot方法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达。结果：单用机械牵张力刺激MG63细胞后OPG蛋白表达上调,且呈时间依赖性,而RANKL蛋白表达无明显变化;单用灯盏花干预MG63细胞后OPG蛋白表达下调,RANKL蛋白表达增加;两者联合干预MG-63细胞后,OPG蛋白表达量减少,RANKL蛋白表达显著增加。结论：灯盏花能拮抗机械牵张力对成骨细胞OPG分泌的刺激作用,促进机械牵张力对成骨细胞RANKL分泌的刺激作用。     

Indian Hedgehog在牵张力促进成骨细胞增殖中的作用研究

目的观察Hedgehog（Hh）信号在牵张力调控成骨细胞增殖中的作用。方法体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,应用Flexcell 4000TM加力系统施加3%和6%的2种牵张应变。用N端Hedgehog重组蛋白（N-Shh）、Hedgehog通道抑制剂环巴胺（cy）和机械通道抑制剂三氯化钆（GdCl3）对成骨细胞进行干预。分别采用细胞计数、甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和流式细胞仪检测成骨细胞的增殖。采用SAS 8.0软件包对结果进行统计分析。结果在成骨细胞体外培养过程中,牵张力促进了成骨细胞的增殖,以6%牵张应变更显著;牵张力仍能促进经cy处理后的成骨细胞的增殖,但这种促进作用能被GdCl3抑制。结论牵张力促进成骨细胞增殖的作用有一部分是通过上调Ihh的表达实现的。     

RAMP1-siRNA 对 CGRP 促 MG-63细胞增殖作用影响的实验研究

目的:探讨阻断降钙素基因相关肽(CGRP)受体活性修饰蛋白(RAMP1)在MG-63细胞中表达对促成骨样MG-63细胞增殖作用的影响。方法:体外转录合成法合成及筛选RAMP1 siRNA,传代培养的MG-63细胞分为:RAMP1 siRNA干扰组、空载体组、空白对照组。实时聚合酶链反应、免疫荧光法分别检测降钙素受体样受体(CRLR)、受体组分蛋白(RCP)在MG-63细胞中mRNA表达及膜上的分布变化。结果:转染siRNA后MG-63细胞RAMP1、CRLR mRNA和荧光强度明显下调(P<0.05),RAMP1干扰组RCP mRNA的表达及荧光强度高于其它2组(P<0.05)。RAMP1 siRNA干扰后,MG-63细胞的增殖被抑制(P<0.05)。结论:转染RAMP1 siRNA降低了MG-63细胞CRLR的表达,抑制了MG-63细胞的增殖能力。     

机械张力对人成骨样细胞TGF-β表达的影响

目的 观察机械张力对人成骨细胞TGF-β基因表达的影响。方法 通过Flexercell细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞MG-63进行6%，12%和24%的拉伸应变加载实验，用RT-PCR反应检测细胞受力后TGF-βmRNA的表达。结果 6%和12%的拉伸率能显著促进MG-63细胞TGF-β的表达，但24%的拉伸率作用对细胞TGF-β基因表达影响不明显。结论 恰当大小的机械张力可以增加成骨细胞TGF-β的表达。过大的应力刺激可能没有这种效应。     

周期性牵张力对人牙周膜细胞MMP-1 mRNA表达的影响

目的:观察周期性牵张应力对人牙周膜细胞(HPDLF)的MMP-1 mRNA表达的影响.方法:对培养在弹性膜培养板上的HPDLF施加0.2 Hz、12%形变率的周期性牵张力,利用原位杂交和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察HPDLF的MMP-1 mRNA的表达.结果:体外培养的HPDLF正常情况下表达MMP-1 mRNA,加载周期性牵张力12 h、24 h、48 h后,随着作用时间的延长,HPDLF的MMP-1 mRNA有持续增强的趋势.结论:周期性牵张力作用下,HPDLF的MMP-1 mRNA的表达增强,加速ECM的代谢活动.     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。     

不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响

目的:研究不同大小机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响.方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加0%、6%、12%和18%的机械牵张力,作用24h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化,用免疫印迹法检测其蛋白表达的变化.结果:细胞受力后,MMP-13 mRNA/TIMP-1 mRNA及蛋白表达随牵张力值的增大明显增加.结论:不同大小机械牵张力可以影响成骨细胞的MMP-13/TIMP-1表达,进而影响骨改建.     

牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应调节的初步研究

目的：探讨牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应的影响。方法：1）采用MTT四唑盐比色法,检测不同剂量的17~β雌二醇（E2）（10^-12-10^-6mol/L）对第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。2）将第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在细胞膜式牵张力施加装置上培养,检测不同浓度17-β雌二醇（10^-10-10^-8mol/L）及5 kPa牵张力联合应用0、12 h后,对兔鼻软骨细胞增殖活性（PI值）的影响。结果：（1）10^-10-10^-8mol/L17-β雌二醇体外培养新西兰白兔兔鼻软骨细胞生长具有刺激作用,且呈剂量依赖性,最大效应浓度为10^-8mol/L,进一步增加E2浓度则刺激作用减弱。10^-6mol/L具有明显抑制性。（2）5 kPa牵张力联合17-β雌二醇培养较17-β雌二醇的单独作用具有更强的促兔鼻软骨细胞增殖作用。结论：牵张力与雌激素可以调节兔鼻软骨细胞增殖活性。     

机械牵张作用对UMR-106细胞骨桥蛋白mRNA和TGF-β1 mRNA表达的影响

目的　探讨机械牵张作用对骨桥蛋白 (osteopontin ,OPN)mRNA和转化生长因子 β1(transforminggrowthfactorbeta 1,TGFβ1)mRNA表达的影响 ,说明正畸性骨改建的分子生物学机制。方法　建立体外培养细胞牵张施力模型 ,利用地高辛标记探针进行原位杂交 ,结合图象分析技术定量化研究基因表达的相对强度。结果　不同牵张强度和频率作用对OPNmRNA和TGF β1mRNA表达影响的差别具有显著性。低强度 低频率作用的影响最为显著 ,2 4h时OPNmRNA的表达强度从 0 16 13降低到 0 12 6 1(P <0 0 5 ) ;48h时TGF β1mRNA的表达强度从 0 0 899增加到 0 175 6 (P <0 0 1)。OPNmRNA和TGF β1mRNA的表达变化趋势相反。 结论　机械牵张作用可显著影响成骨细胞OPNmRNA和TGF β1mRNA的表达水平。低强度 低频率刺激对TGF β1mRNA表达的影响最显著 ,支持正畸临床所证明和提倡的持续轻力移动牙齿的原则。     

一步微弧氧化法处理钛合金的体外生物相容性研究

目的　研究一步微弧氧化法处理钛合金（Ti6Al4V）的体外生物学性能,为下一步临床应用微弧氧化法处理钛合金种植体提供前期理论基础。方法　通过一步微弧氧化法在Ti6Al4V表面生成膜层并表征膜层形态（实验组）,设置对照组为未处理的Ti6Al4V和喷砂酸蚀处理的Ti6Al4V,3组分别与成骨细胞共同培养,测定成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性以及Ⅰ型胶原蛋白（collagen Ⅰ,COL-Ⅰ）、骨钙素（osteocalcin,OC）的mRNA相对表达情况。结果　微弧氧化处理后Ti6Al4V表面含有大量的陶瓷烧结颗粒,以羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）为主要成分。3组试样的体外实验结果表明,经微弧氧化处理的Ti6Al4V表面的细胞增殖高于其他两组,细胞内的ALP活性、COL-Ⅰ、OC的mRNA相对表达也均高于其他两组。结论　通过微弧氧化法在Ti6Al4V表面生成的陶瓷膜对成骨细胞的增殖分化有促进作用,有良好的生物相容性。     

细胞骨架完整性对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达的影响

目的 研究细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达中的作用,为进一步探索骨组织力传导机制提供依据.方法 原代培养BALB/c小鼠成骨细胞,将原代培养的成骨细胞分为对照组和细胞松弛素 D组,细胞松弛素D组使用细胞松弛素D破坏细胞骨架.每组一半细胞加载1.2 Pa的流体剪切力,另一半不加载.分别用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫荧光检测c-fos基因mRNA和蛋白、细胞骨架蛋白的表达水平,并对结果进行双因素方差分析和成组t检验.结果 无论是对照组还是细胞松弛素D组,流体剪切力加载均可使成骨细胞c-fos基因mRNA相对水平(分别为0.1637±0.0303和0.0104±0.0070)和蛋白荧光强度(分别为177.14±9.37和150.95 ±6.17)升高,与未加载流体剪切力的对照组和细胞松弛素D组细胞(mRNA相对水平分别为0.0057±0.0021和0.0032±0.0014,蛋白荧光强度分别为117.96±4.11和119.77±5.19)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).流体剪切力加载下,细胞松弛素D组细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 细胞松弛素D对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达起拮抗作用.保持细胞骨架的完整性是流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因表达过程中的重要条件.     

雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞成骨分化及机制研究

目的　探究雌激素联合机械张力对人牙周膜成纤维细胞成骨分化的影响及机制。方法　分离hPDLF细胞并鉴定,将hPDLF细胞分为对照组、17β-雌二醇组、机械张力组、17β-雌二醇联合机械张力组;按细胞给药和加力方案处理后,检测细胞增殖能力,茜素红染色检测hPDLF细胞成骨分化,qRT-PCR检测成骨基因mRNA的表达,Western blot检测成骨蛋白、雌激素受体表达及Akt信号通路的激活。结果　鉴定所提取到的hPDLF细胞符合其特征;17β-雌二醇组和机械张力组细胞增殖能力、茜素红染色OD值均显著高于对照组;雌激素受体ER-β、成骨基因RUNX2、OCN、OSX、OPN表达,Akt磷酸化水平均显著高于对照组;雌激素联合机械张力细胞增殖能力、茜素红染色OD值显著高于17β-雌二醇和机械张力组单独作用组,雌激素受体ER-β、成骨基因RUNX2、OCN、OSX、OPN表达,Akt磷酸化水平均显著高于17β-雌二醇和机械张力组单独作用组。结论　雌激素联合机械张力能够促进hPDLF细胞成骨分化,并且促进雌激素受体和成骨基因的表达,以及Akt信号通路的激活。     

流体剪切力与17-β雌二醇对MC3T3-E1细胞增殖活性协同作用的研究

目的 探讨对体外培养的成骨细胞增殖活性促进作用最佳的17-β雌二醇的浓度及作用时间、流体剪切力（FSS）的力值及作用时间,以及此双因素共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。方法 成骨细胞系MC3T3-E1细胞传代培养后,分别对其施加不同浓度的17-β雌二醇和不同力值的FSS,采用MTT法检测细胞的增殖情况,并检测ALP 活性,筛选出最佳的浓度及力值;再将二者共同作用于MC3T3-E1细胞,检测其增殖情况和ALP活性。结果 浓度为10-8 mol·L-1的17-β雌二醇作用5 d时,MC3T3-E1细胞的增殖及ALP活性优于其他17-β雌二醇处理组;FSS力值为12×10-5 N作用60 min时细胞的增殖及ALP活性大于其他FSS处理组。当二者同时作用于MC3T3-E1细胞时,细胞的增殖活性大于任一单因素处理组。结论 17-β雌二醇和FSS对成骨细胞活性的促进作用皆有一个适宜的阈值;二者具有协同作用,对成骨细胞分化及增殖功能的影响优于单一因素作用。     

壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米复合物的制备及细胞相容性研究

目的:由壳聚糖(chitosan,CS)和磷酸化壳聚糖(phosphorylated chitosan,PCS)通过静电自组装仿生合成一种新型骨修复材料并体外评价其细胞相容性。方法:对CS进行磷酸根接枝,合成PCS,然后将PCS溶液逐滴滴加到CS的醋酸溶液中,得到壳聚糖/磷酸化壳聚糖复合物(CS/PCS)。将CS/PCS水胶体置于饱和的Ca(OH)_2溶液中矿化供细胞培养用。第3～5代成骨细胞与矿化后的CS/PCS复合物共同培养,以羟基磷灰石组为对照组。倒置显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。MTT法检测细胞的增殖;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测细胞的分化。结果:CS/PCS复合物呈多孔网状结构,矿化后的CS/PCS可以促进成骨细胞的增殖和分化。结论:仿生合成的CS/PCS复合水胶体矿化后显示了良好的细胞相容性,可以促进成骨细胞的增殖和分化,可作为一种新型的骨修复材料。     

成骨样细胞受张力作用后PGE_2含量及IGF-I表达变化

目的 观察机械张力对成骨样细胞合成PGE2和IGF-I基因表达的影响。方法 通过Flexercell细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞Saos-2进行6％、12％和24％的拉伸应变加载实验。用放免法和Northern斑点杂交技术检测细胞受力后的PGE2水平和IGF-ImRNA表达变化。结果 三种拉伸率均能显著增加Saos-2细胞PGE2的含量。虽然6％和12％的应力作用能明显增加IGF-I的表达,但24％的力值刺激几乎对IGF-I表达无影响。结论 张应力可以促进人成骨样细胞PGE2的合成,但只有恰当大小的力值才能增加其IGF-I基因的表达。