CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用

目的 :构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗 ,并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用。方法 :抽提CVB3RNA ,以RT PCR扩增VP1基因 ,克隆于真核表达载体 pcDNA3中 ,构建质粒pcDNA3 VP1。将该质粒转染Hela细胞 ,观察其表达情况 ;以 5 0 μgpcDNA3 VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠 3次 ,检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答。间隔 4wk以 5×LD50 的CVB3攻击小鼠 ,观察攻击后小鼠的存活情况。结果 :构建了重组质粒 pcDNA3 VP1,并在体外获得有效表达。以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠 ,可诱生高水平的IgM和IgG ,VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于 pcDNA3免疫的对照组。病毒攻击试验表明 ,pcDNA3 VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活 ,其心肌组织未见明显的病理学改变 ;而对照小鼠平均仅存活 6 .7d ,心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润。结论 :pcDNA3 VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答 ,保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击     

Chitosan-DNA基因免疫诱导粘膜特异性免疫应答及其抗CVB3感染作用

目的：构建新型粘膜基因疫苗，诱生CVB3VP1特异性粘膜免疫应答，探讨粘膜免疫抗CVB3感染的作用，为病毒性心肌炎的特异性防治奠定基础。方法：抽提CVB3 RNA，以RT-PCR扩增得VP1基因，插入真核表达载体pcDNA3中，构建质粒pcDNA3-VP1，以Chitosan多糖包裹形成Chitosan-DNA基因疫苗。将该质粒转染Hela细胞，观察其体外表达情况。以50辉DNA剂量的Chitosan-DNA疫苗滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答；隔4周以5LD50活CVB3致死攻击小鼠，观察攻击后存活情况。结果：制备了直径为80-100nm的Chitosan-DNA复合物颗粒，体外转染证实Chitosan-DNA复合物中VPl的表达高于pcDNA3-VP1质粒-Lipofectamine的表达水平。该疫苗滴鼻3次免疫后，不仅诱生了高水平的IgG，而且诱生了高水平的粘膜IgA抗体，第6周抗体P/N值分别达3．5和3．2。特异性细胞免疫应答研究发现，该疫苗诱生了较强的VP1特异性CTL杀伤作用，并显著高于pcDNA3-VP1和pcDNA3组。CVB3攻击后，可保护33．3％小鼠长期存活，而pcDNA3和pcDNA3-VP1质粒滴鼻免疫对照组的平均存活天数分别为8．5和10．8天。病理学研究显示：Chitosan-DNA免疫小鼠心肌组织基本正常，而对照小鼠死亡前心肌显示大量的灶性坏死和炎性浸润。结论：Chitosan-DNA基因疫苗滴鼻免疫可诱生CVB3特异性粘膜IgA应答及CTL反应，具有一定的抗CVB感染的免疫保护力。     

人IL-2信号肽基因增强柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答

目的将人白细胞介素2(hIL-2)信号肽基因与柯萨奇病毒B组3型(CWB3)的VP1基因融合，构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1；免疫小鼠后，通过测定血清特异性中和抗体效价及对致死量CVB3攻击的保护作用，评价疫苗的免疫效果。方法采用重叠区基因扩增法，将hIL-2信号肽基因连同其下游11个氨基酸残基的基因与CVB3 VP1基因拼接，获得分泌型VP1(sVP1)的基因；将sVP1基因克隆至真核表达载体pcDNA3，构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1；肌注免疫小鼠，测定血清中CVB3特异性中和抗体的效价；第3次免疫后2周，腹腔内注射1000TCID50的CVB3，观察小鼠生存情况。结果成功构建了分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1，插入的sVP1基因中含有hIL-2信号肽及其下游11个氨基酸残基的基因以及VP1基因；pcDNA3／sVP1可比对照质粒pcDNA3／VP1诱导小鼠产生更高水平的中和抗体。结论hIL-2信号肽基因增强了柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答，为进一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了实验基础。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

接头长度对MDC与CVB3VP1融合基因疫苗免疫效果的影响

目的构建表达不同接头（linker）长度的巨噬细胞源趋化因子（MDC）与CVB3VP1融合基因疫苗，观察接头长度对融合基因疫苗免疫效果的影响。方法构建表达接头长度分别为10、15和19个氨基酸的重组质粒pcDNA3／MDC-L-VP1；将6—8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为A-E5组，分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3／VP1、pcDNA3／MDC-L10-VP1、pcDNA3／MDC-L15-VP1和pcDNA3／MDC-L19-VP1，每次接种100μg/只，4周注射1次，共3次，每次免疫后第14天眼眶静脉采血，用微量中和试验滴定血清中和抗体效价。第3次免疫后3周，每组取3只小鼠，制备脾细胞，用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性；每组取3只小鼠以3LD50 CVB3病毒攻击，第7天取血处死，检测血中病毒滴度。结果成功构建了3种不同接头长度的质粒；第3次免疫后，E组中和抗体滴度和小鼠脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性显著高于其他各组，血中病毒滴度显著低于其他各组（P〈0．01）。结论融合基因疫苗pcDNA3／MDC-L19-VP1能诱导小鼠对CVB3VP1产生较强的体液和细胞免疫，有效地抑制了病毒的增殖。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3VP1/pcDNA3真核表达质粒的构建及免疫效果观察

用ＲＴ ＰＣＲ从ＣＶＢ３ 感染细胞中扩增出ＶＰ１ 片段,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ 中,转化大肠杆菌Ｃ６００,扩增后的质粒经ＣｓＣｌ 密度梯度离心纯化,体外转染ＣＯＳ ７ 细胞,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测表达产物;并经胫骨前肌注射小鼠,每鼠１００μｇ／ 次,隔４ 周加强一次,共３ 次。免疫后不同时间检测抗体、淋巴细胞增殖反应等免疫指标。结果显示重组质粒体外转染真核细胞表达ＶＰ１ 蛋白,免疫小鼠后产生了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。表明ＣＶＢ３ ＶＰ１ ＤＮＡ疫苗获得初步有效结果。     

柯萨奇病毒B3 VP1蛋白、rAd/VP1和pcDNA3/VP1的免疫效果比较

目的 观察柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)衣壳蛋白VP1、表达VP1蛋白的重组腺病毒rAd/VP1和重组质粒pcDNA3/VP1的免疫效果.方法 用原核细胞表达VP1蛋白并纯化、扩增重组腺病毒rAd/VP1,扩增并提取真核表达质粒pcDNA3/VP1.BALB/c小鼠随机分为4组,每组18只,分别在股四头肌注射VP1蛋白、rAd/VP1、pcDNA3/VP1和PBS.VP1蛋白组和pcDNA3/VP1组免疫3次,间隔3周;rAd/VP1组免疫2次,间隔2周.VP1蛋白、pcDNA3/VP1和rAd/VP1每次每只注射剂量分别为50μg、100μg和1.2×107PFU.用ELISA法和微量中和试验法检测各次免疫后血清CVB3特异性IgG抗体和中和抗体滴度;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果 VP1蛋白组血清特异性IgG抗体和中和抗体滴度明显高于其他实验组(P＜0.05),而脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性低于rAd/VP1组(P＜0.05);致死量病毒攻击后,VP1蛋白组血中病毒滴度低于pcDNA3/VP1和rAd/VP1组(P＜0.05),生存率明显高于这两组(P＜0.05).结论 VP1蛋白疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答,对动物有明显的免疫保护作用,免疫效果优于质粒pcDNA3/VP1和重组腺病毒rAd/VP1.

Abstract：

Objective To compare the immune effects of Coxsackievirus B3 (CVB3) capsid protein VP1 expressed bacterially, recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1which express VP1 protein in mice. Methods After expressed in prokaryotic cells, VP1 protein was purified. Recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1 were amplified and extracted. Six to 8-week-old, male BALB/c mice were divided into four groups randomly. Each group contained 18 mice. The mice of pcDNA3/VP1 group or VP1 protein group were immunized intramuscularly with three injections at three weeks apart, of recombinant plasmid pcDNA3/VP1 at a dose of 100 μg/mouse or recombinant protein VP1 at a dose of 50 μg/mouse. The mice of rAd/VP1 group were immunized intramuscularly twice at two weeks interval with rAd/VP1 at a dose of 1.2 × 107 PFU. The control group was mock-immunized with 100 μl of PBS intramuscularly. Mice were bled from the retroorbital sinus plexus every two weeks after each immunization. ELISA and micro-neutralization test were used to detect levels of CVB3-specific IgG antibody and neutralizing antibody titers in the sera of immunized mice. Three weeks after the last immunization, the cytotoxic T lymphocyte(CTL) killing activity of spleen lymphocytes was detected with CCK-8 assay. Subsequently, virus titers in the sera of immunized mice were determined by the 50% cell culture infective dose( CCID50 ) assay on HeLa cell monolayers and percentage of animals surviving were observed after lethal CVB3 attack over a period of 21 days. Results The titers of specific IgG antibody and neutralizing antibody in sera of VP1 protein immunized mice were higher than other groups( P ＜0.05 ). While CTL killing activity of spleen lymphocytes of VP1 protein immunized mice was lower than mice in rAd/VP1 group( P ＜0. 05). Virus titers in sera of VP1 protein immunized mice were lower than the mice in pcDNA3/VP1 or rAd/VP1 groups ( P ＜ 0.05 ), while survival rate was significantly higher than these two groups ( P ＜ 0.05 ).Conclusion VP1 protein induced higher level of humoral immune response and acquired obvious immune protection effects in mice. The immunizing potency of VP1 protein vaccine surpassed plasmid pcDNA3/VP1or recombinant adenovirus rAd/VP1. It appeared to be a promising candidate among the three different vaccines.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.