非小细胞肺癌组织中高表达的miR-1269 对肺癌细胞A549 生物学行为的影响

目的:探讨miR-1269 在非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）组织中的表达和对人NSCLC A549 细胞生物学特性的影响及其作用机制。方法：选取2017 年1 月至2018 年1 月在河北医科大学第四医院胸外科进行首次手术切除的34例新鲜NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织,应用qRT-PCR 检测NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织中miR-1269 的表达水平。将miR-1269 mimics 和mimics NC转染至A549 细胞后,应用MTS实验、细胞划痕实验和Transwell 实验检测A549 细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术检测其细胞周期的变化。生物信息学软件预测miR-1269 的靶基因,并通过Western blotting 和双荧光素酶报告基因实验验证miR-1269 对靶基因的调控作用。采用Western blotting 检测已转染的A549 细胞的细胞周期依赖性激酶抑制剂p21、细胞周期蛋白D2 以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白ZEB2 和E-cadherin 的表达情况。结果：NSCLC癌组织中miR-1269 的表达水平显著高于对应的癌旁组织（2.81±2.27 vs 1.61±1.36,P<0.05）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于空白对照组和mimics NC转染组（均P<0.01）。转染miR-1269-mimics 的A549 细胞S期细胞比例明显高于mimics NC转染组[ （46.54±1.57）% vs（23.32±3.15）%,P<0.01]。miR-1269 可与FOXO1 基因3’端非翻译区的结合位点相结合,且过表达miR-1269 后,A549 细胞中FOXO1 的表达水平及荧光素酶报告基因的活性均明显降低（均P<0.01）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞中p21、E-cadherin 蛋白表达水平降低（均P<0.05）,而CyclinD2、ZEB2 蛋白表达水平升高（均P<0.05）。结论：miR-1269 在NSCLC组织中表达上调,并且能够促进A549 细胞的增殖、迁移、侵袭能力和影响细胞周期进程;其作用机制可能与靶向调控抑癌基因FOXO1 的表达有关。     

miR-1290通过抑制干扰素调节因子-2调控非小细胞肺癌的增殖

  目的  探讨微小RNA-1290（miR-1290）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达及其相关调控机制。  方法  采用实时荧光定量PCR检测成都市双流区第一人民医院2014年6月至2017年6月41例NSCLC患者癌组织、癌旁组织以及NSCLC细胞株A549、H460及正常支气管上皮细胞BEAS-2B中miR-1290表达;qPCR、Western blot检测癌组织、癌旁组织IRF2 mRNA和蛋白表达;将A549和H460细胞分为miR-1290 mimic组（转染miR-1290 mimic）、miR-1290 inhibit组（转染miR-1290 inhibit）和miR- 1290 NC组（不转染）。分别于转染24、48、72、96 h后采用CCK-8法检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成数,Transwell小室检测细胞侵袭数,双荧光素酶报告基因实验检测miR-1290与干扰素调节因子-2（interferon regulatory factor,IRF2）3′-UTR结合情况,qPCR检测不同miR-1290表达水平的A549和H460细胞IRF2 mRNA表达。  结果  癌组织miR-1290相对表达量明显高于癌旁组织,IRF2 mRNA和蛋白相对表达量明显低于癌旁组织,差异具有统计学意义（P < 0.05）;NSCLC组织miR-1290表达与IRF2 mRNA、蛋白表达呈显著负相关（P < 0.05）。NSCLC患者中,淋巴结转移者miR-1290表达明显高于无淋巴结转移者,Ⅲ/Ⅳ期患者miR-1290表达明显高于Ⅰ/Ⅱ期,差异具有统计学意义（P < 0.05）。转染72、96 h后,A549和H460细胞miR-1290 mimic组增殖能力明显高于miR- 1290 NC组,miR-1290 inhibit组增殖能力明显低于miR-1290 NC组,差异具有统计学意义（P < 0.05）。A549和H460细胞中miR-1290 mimic组细胞克隆数和侵袭细胞数明显高于miR-1290 NC组,miR-1290 inhibit组克隆数和侵袭细胞数明显低于miR-1290 NC组,差异具有统计学意义（P < 0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示miR-1290能与IRF2 3′-UTR结合,明显降低荧光值（P < 0.05）。A549和H460细胞中,miR-1290 mimic组IRF2相对表达量明显低于miR-1290 NC组,miR-1290 inhibit组IRF2相对表达量明显高于miR-1290 NC组,差异具有统计学意义（P < 0.05）。  结论  miR-1290在NSCLC组织和细胞中高表达,miR-1290可能通过与IRF2结合,促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。      

miR-211通过靶向下调SATB2表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭

目的:探讨miR-211及SATB2基因在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织和细胞中的表达情况,探究miR-211在NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用及其相关机制。方法:双荧光素酶报告系统验证miR-211和SATB2的相互作用机制;qRT-PCR检测miR-211和SATB2在NSCLC组织及癌旁组织中的表达情况;向A549细胞中转染miR-211 mimics、miR-211 inhibitor和pcDNA3.1-SATB2,检验转染效率及转染后A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8实验和Transwell小室分别检测miR-211和SATB2表达变化对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:双荧光素酶报告系统结果提示SATB2 3' UTR是miR-211直接结合的靶位点。NSCLC组织中miR-211表达上调,SATB2表达下调,两者表达呈线性负相关(P＜0.05)。转染miR-211 mimics显著下调A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05);转染miR-211 inhibitor和pcDNA3.1-SATB2使A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白的表达水平增高(P＜0.05)。CCK-8实验显示,相较于对照组,miR-211过表达组的A549细胞增殖率显著增加(P＜0.05),miR-211抑制组和SATB2过表达组的A549细胞增殖能力下降(P＜0.05)。Transwell小室实验结果显示,与对照组相比,miR-211抑制组和SATB2过表达组的A549细胞迁移和侵袭能力明显降低(P＜0.05)。在miR-211过表达组共转染SATB2过表达,使miR-211介导的对A549细胞增殖、迁移及侵袭的促进作用受到抑制。结论:下调miR-211的表达可以增加NSCLC细胞中SATB2转录及转录后表达水平,从而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

miR-126对细胞周期的调控及其与肺癌患者预后的关系

目的研究miR-126在肺癌中的表达变化及其与癌细胞周期调控的关系,并分析miR-126表达对肺癌患者术后生存期的影响。方法对肺癌细胞株A549和49例临床肺癌手术标本进行实时定量RT-PCR检测miR-126的表达;A549细胞转染miR-126表达载体,MTT和流式细胞术检测miR-126表达对癌细胞增殖和细胞周期的影响;Kaplan-Meier曲线和log-rank分析方法比较miR-126高、低表达组之间无瘤生存期和总生存期的差别。结果A549肺癌细胞miR-126低表达（2.10±0.67）,转染miR-126表达载体后,miR-126表达升高（12.33±1.67）;转染miR-126后96小时,A549细胞存活率为（68.33±6.67）%,明显低于亲本A549细胞（105.33±8.58）%,差异有统计学意义（P〈0.001）;与亲本A549细胞比较（G0/G1期：37.48±3.28;S期：62.03±5.23）,转染miR-126的A549细胞G0/G1期细胞比例上升（53.67±6.06）,S期下降（43.21±3.75）,差异有统计学意义（P〈0.001）;肺癌组织miR-126表达水平（12.41±4.34）明显低于癌旁肺组织（23.29±6.28）,差异有统计学意义（P〈0.001）;miR-126高表达组无瘤生存期和总生存期均明显高于低表达组（P〈0.01,P〈0.001）。结论 miR-126在肺癌的发生、发展中有重要作用,可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。     

miR-506通过调控MCL-1抑制耐阿立替尼非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化的作用机制

目的:探究miR-506通过调控MCL-1对耐阿立替尼非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）及侵袭转移的影响和作用机制。方法:收集2017年12月至2018年12月我院肿瘤科收治的经PET-CT结合组织病理活检及药敏试验确诊为耐阿立替尼的74例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织以及人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,分别采用细胞转染、免疫组化染色（IHC）、qRT-PCR和Western Blot法检测上述临床组织和细胞样本中miR-506、MCL-1、BAX/Bcl-2凋亡信号途径及EMT标志蛋白表达水平;此外,采用Transwell细胞实验观察miR-506过表达和MCL-1敲减对A549细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:免疫组化（IHC）结果显示肺癌患者癌组织中浸润性坏死性病理损伤较癌旁组织明显加重,且癌组织中MCL-1的阳性表达率为94.64%,明显高于癌旁组织的23.27%（P＜0.05）。qRT-PCR和Western Blot结果显示,肺癌组织中miR-506、BAX和E-cadherin的表达明显低于癌旁组织,而MCL-1、Bcl-2和N-cadherin的表达显著高于癌旁组织（P＜0.05）。细胞实验结果表明miR-506过表达和MCL-1敲减能够明显上调BAX和E-cadherin的表达,同时抑制Bcl-2和N-cadherin的表达（P＜0.05）;此外,miR-506过表达和MCL-1敲减均能显著抑制肺癌A549细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。结论:miR-506可能通过抑制BAX/Bcl-2/MCL-1凋亡途径发挥抑制耐阿立替尼非小细胞肺癌A549细胞EMT及诱导细胞凋亡作用,有望为临床抗肺癌转移及凋亡抑制靶向治疗提供新分子和靶点。     

milk-145通过下调OCT4基因仰制肺腺癌干细胞增殖

背景与目的 miR-145是通过miRNA芯片及qPCR验证筛选出的一种潜在肺癌保护性miRNA。本研究旨在探讨miR-145与肺癌干细胞之间的关系及分子机制。方法 miRNA芯片对肺腺癌患者瘤旁和正常组织进行表达谱分析;生物信息学软件预测miR-145潜在的靶基因;脂质体2000介导转染miR-145模拟物和阻遏物进入A549细胞株;实时定量PCR检测miR-145表达水平;Western blot检测OCT4蛋白水平;双荧光素酶报告基因验证miR-145是否作用于OCT4mRNA的3'UTR区预测靶位;细胞增殖实验检测miR-145对于A549细胞生长的作用;流式细胞术检测干细胞表型CD133+的表达。结果在肺腺癌组织中miR-145表达明显低于瘤旁正常组织;miRanda软件预测OCT4是miR-145潜在靶基因;与对照组相比,miR-145模拟物组和阻遏物组miR-145表达分别明显上调和下调;miR-145对A549细胞的生长有双向调节作用,过表达miR-145抑制细胞生长;过表达miR-145可明显降低OCT4蛋白水平及干细胞表型CD133百分比,而抑制miR-145表达则明显增加OCT4蛋白水平...     

p53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的： 探讨P53 抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法： 收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma, NSCLC）患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53 基因的真核表达载体（pcDNA3.1-P53）和突变载体\[pcDNA3.1-P53 R273H(CGT-CAT)\],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组（Vector或NC-siRNA）和实验组（Flag-P53或P53-siRNA）;Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因（OCT4）为miR-145的靶标分子。结果： NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织\[(2.31±0.13) vs (3.51±0.27),P<0.01\];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达\[(1.84±0.14) vs (1.00±0.00),P<0.01\];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<001)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论：P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。     

miR-194-5p调控LMNB1抑制肺腺癌细胞的生长转移

目的:探究miR-194-5p调控LMNB1对肺腺癌细胞生长转移的作用。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肺腺癌组织和癌旁组织中miR-194-5p、LMNB1表达水平。体外培养肺腺癌细胞A549,分为对照组、miR-194-5p mimics阴性对照组、miR-194-5p mimics组。转染处理后,CCK-8实验检测各组A549细胞增殖情况,比较各组细胞活力;流式细胞实验检测各组A549细胞凋亡率;细胞划痕及Transwell小室侵袭实验分别检测各组A549细胞迁移、侵袭力,比较各组细胞迁移、侵袭数;免疫印迹实验检测各组A549细胞凋亡蛋白caspase-3、Bax和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin、Vimentin表达;qRT-PCR实验及免疫印迹实验分别检测各组A549细胞miR-194-5p、LMNB1 mRNA表达及LMNB1蛋白表达。结果:相比癌旁组织,肺腺癌组织中miR-194-5p表达水平明显降低（P＜0.05）,LMNB1表达水平明显升高（P＜0.05）。相比对照组,miR-194-5p mimics组A549细胞活力、细胞迁移数、细胞侵袭数、LMNB1 mRNA表达水平、Vimentin和LMNB1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率、miR-194-5p表达、caspase-3、Bax和E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。miR-194-5p mimics阴性对照组A549细胞上述各指标与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:miR-194-5p可下调LMNB1表达,抑制肺腺癌细胞增殖,促进其凋亡,并降低其迁移及侵袭能力。     

miRNA-101通过下调COX-2的表达影响肺癌细胞的生物学功能

目的：探讨miRNA-101(miR-101)在肺癌组织和细胞中的表达及其对人肺癌细胞增殖、克隆形成和成瘤能力的影响。方法： 采用Western blotting和实时荧光定量RT-PCR技术分别检测10例患者肺癌组织及相应癌旁组织、人肺癌细胞A549和NCI-H26及正常人胚肺成纤维细胞MRC-5中环氧合酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）及miR-101的表达。A549和NCI-H26细胞分别转染miR-NC和miR-101构建过表达miR-101的细胞系及其对照,Western blotting、CCK-8和克隆形成实验分别检测过表达miR-101对A549、NCI-H26细胞中COX-2的表达、细胞增殖和克隆形成能力的影响。用A549、A549/NC、A549/101细胞在BALB/c裸鼠皮下构建移植瘤模型,观察过表达miR-101对A549细胞小鼠移植瘤生长的影响。结果： 在肺癌组织和A549、NCI-H26细胞中,COX-2的表达明显高于癌旁组织（t=20.03,P=0.001）和MRC-5细胞（t=14.59,P=0.012）,而miR-101的表达则相反（组织：t=18.33,P=0.002 ;细胞：t=28.95,P=0.000）。成功构建过表达miR-101的A549/101、NCI-H26/101细胞系,与A549、NCI-H26细胞相比,A549/101（t=26.03,P=0.000）、NCI-H26/101（t=23.29,P<0.01）细胞内COX-2表达量显著降低,A549/101和NCI-H26/101细胞的活力和克隆形成能力也显著降低（均P<0.05）。A549/101细胞小鼠皮下肿瘤的生长速度较A549细胞和A549/NC细胞显著减慢（F=14.81,P=0.003）。结论： 肺癌组织和A549、NCI-H26细胞中miR-101低表达、COX-2高表达,过表达miR-101可以抑制A549、NCI-H26细胞的增殖,其机制可能与下调了COX-2表达有关。     

miR-127在肺癌中的表达及功能

 目的 探讨miR-127在肺癌中的表达及对其肺癌细胞生物学特性的影响。方法 收集20例患者的肺癌组织及癌旁组织，通过实时荧光定量PCR检测miR-127在肺癌及癌旁组织中的表达水平。应用mimics转染A549细胞株，采用平板克隆、MTT法检测miR-127 mimics组、空白载体转染组（NC）肺癌细胞的增殖活性。Transwell实验计算肺癌细胞过膜数量，研究miR-127与肺癌细胞迁移作用的关系。结果 miR-127在肺癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织（0.55±0.05 vs. 1.45±0.13, P=0.001）。肺癌组织中miR-127的表达随着病理分期恶性程度的增高而降低（H=6.528, P=0.034）。平板克隆及MTT实验结果显示miR-127 mimics组的细胞活性及增殖明显受抑制（P=0.0032; P=0.0045），Transwell实验显示miR-127 mimics组的细胞过膜数量（79±18/视野）明显低于NC组（352±21/视野），差异有统计学意义（P=0.002）。结论 miR-127在肺癌组织中低表达，其在抑制肺癌细胞的增殖和转移过程中发挥重要作用，可作为肺癌的潜在临床诊断标志物。     

miRNA-451逆转非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制研究’

目的：探讨microRNA-451（miR-451）逆转非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂的耐药性及其可能的作用机制。方法：应用实时荧光定量PCR法（real～timefluorescentquantitativePCR,qRT—PCR）检测耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-451的表达差异,同时检测A549／DDP细胞转染miR-451mimic后miR-451表达的变化;分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549／DDP细胞对DDP药物敏感度,细胞增殖能力,联合DDP处理后细胞凋亡变化;Western印迹法检测转染后A549／DDP细胞Akt、P—Akt（Ser473）、bcl-2和bax的表达变化。结果：miR-451在耐DDP细胞株A549／DDP中的表达量显著低于敏感细胞株A549（P〈0．05）,A549／DDP细胞转染miR-451mimic24h后,细胞中miR-451的表达水平较对照组明显提高（P〈0．05）。在A549／DDP细胞中过表达miR-451可产生以下效应：相较于对照组,DDP对A549／DDP／miR-451细胞的半数抑制浓度（half inhibitioncon centration,IC50）减低（P〈0．05）,A549／DDP／miR-451细胞的增殖能力减弱,A549／DDP／miR-451经过DDP处理后细胞凋亡增多（P〈0．05）。Western印迹法结果显示,与对照组比较,转染miR-451mimic的A549／DDP细胞P—Akt（Ser473）、bcl-2表达水平降低;bax表达水平升高。结论：miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调P—Akt（Ser473）、bcl-2蛋白表达而逆转A549／DDP细胞对DDP的耐药性。     

GST-π、P—gP、LRP在人肺癌细胞株中的表达与多西他赛治疗敏感性的关系

目的：探讨不同肺癌细胞株中谷胱甘肽转移酶（GST-π）、P-糖蛋白（P～gP）、肺耐药蛋白（lung reistanceprotein,LRP）的mRNA表达差异及对多西他赛化疗敏感性的预测价值。方法：采用RT—PCR技术检测ANIP973细胞株、A549细胞株,A2细胞株中GST-π、P—gP、LRP蛋白mRNA的表达,结合多西他赛体外药物敏感实验,分析GST-π、P—gP、LRP的mRNA表达水平与多西他赛化疗敏感的相关性。结果：在肺癌细胞株中,P—gp、LRP、GST-竹在腺癌细胞株中表达高于鳞癌细胞株,从高到低依次为ANIP973、A549、A2细胞株,差异有统计学意义。多西他赛药敏试验显示细胞株生存曲线受药物抑制由大到小为A2、A549、ANIP973细胞株。多西他赛IC50均值从高至低依次为ANIP973、A549、A2细胞株。经单向方差分析不同细胞株之间IC50差异显著（F=29．636,P=0．000）。3种肺癌细胞株中多西他赛Ic50与GST-π（0=0．626,P=0．001）、P-gp（rs=0．453,P=0．027）、LRP（rs=0．398,P=0．045）表达水平呈正相关,且与GST-π关系最密切（ri〉0．5）。结论：检测肺癌细胞中GST-π、P—π、LRP各蛋白mRNA表达水平对多西他赛化疗敏感性具有一定预测价值,联合检测三者可能对临床判断化疗效果以及合理选择化疗药物具有指导作用。     

shRNA沉默环指蛋白146基因对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及其相关蛋白表达的影响

目的：shRNA沉默环指蛋白146（RNF146）基因,观察非小细胞肺癌细胞中RNF146沉默对肺癌细胞迁移和侵袭及其相关蛋白表达的影响。方法：逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）和Western blot方法用于筛选RNF146高表达肺癌细胞系。构建shRNA-RNF146真核表达载体,瞬时转染A549和H1299肺癌细胞,West-ern blot检测转染效率。划痕实验评价肺癌细胞体外迁移能力;Buyden小室实验检测肺癌细胞体外侵袭能力。Western blot检测肺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法筛选RNF146高表达肺癌细胞系,显示 A549和 H1299细胞中 RNF146蛋白均高于其它细胞系。shRNA -RNF146转染A549和H1299细胞系后,划痕实验显示转染组细胞24小时迁移率明显低于空载体组和未转染组（ P＜0.01）。Buyden小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少（ P＜0.05）。West-ern blot检测与细胞迁移和侵袭相关的调控蛋白（ MMP2、MMP7、MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等）的表达情况,结果显示干扰 RNF146后 A549细胞中 MMP2和 MMP7表达明显减少,而 MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化不明显。结论：RNF146可能通过调控MMP2和MMP7的蛋白水平促进肺癌细胞迁移和侵袭。     

靶向 siRNA 沉默 NF -κB/p65对肺腺癌细胞株 A549增殖与凋亡的影响

目的：研究运用 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制 NF -κB/ p65基因的表达对人肺腺癌细胞株 A5492细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨 NF -κB/ p65基因在肺腺癌发生发展中的作用。方法：利用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000将人 NF -κB/ p65的小干扰 RNA 转染入肺腺癌细胞株 A549中。运用 real time - PCR 和 Western blot 技术检测 A549细胞内 NF -κB/ p65、增殖相关基因 Cyclin D1和凋亡相关基因 Bcl-2、Bax 的 mRNA 的转录水平和蛋白的表达情况,MTT 法检测细胞的增殖活力,显微镜下观察细胞的生长情况。结果：NF -κB/ p65 siRNA 能有效地抑制 A549细胞中 NF -κB / p65基因在 mRNA 水平上的表达（P﹤0.001）,同时下调 Cyclin D1和 Bcl -2的表达（均 P ﹤0.01）。上调 Bax 表达（P ﹤0.001）;蛋白表达也具同样趋势。MTT 实验证明 p65 siRNA 转染组中细胞增殖减慢;显微镜镜下观察显示,细胞生长减慢,凋亡形态改变明显。结论：体外实验初步证明 NF -κB/ p65基因在肺腺癌细胞株 A549增殖分化与凋亡方面扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制肺腺癌细胞株 A549增殖并诱导其凋亡。进一步证实 NF -κB/ p65对 Cyclin D1、Bcl -2、Bax 具有调控作用,他们共同参与了肺腺癌的发生发展过程。     

肺腺癌A549细胞抗失巢凋亡相关基因的确认及C8orf4基因的表达

目的：比较抗失巢凋亡及正常贴壁生长肺腺癌A549细胞基因组表达差异,从中筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因,并探讨C8orf4基因的高表达及其对失巢凋亡的正性调剂作用意义。方法：建立抗失巢凋亡肺癌A549细胞系;用基因芯片技术检测其与正常贴壁生长A549细胞的差异基因,利用NCBI Pubmed数据库筛选出肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,找出差异表达倍数最大的基因,运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术及蛋白质印迹技术测定其表达。结果：共检测到表达差异的基因745个,筛选出63个与肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,C8orf4基因差异表达倍数最大,在脱落培养A549细胞中C8orF4基因及其编码蛋白表达明显高于贴壁培养A549细胞,P〈0.02。结论：基因芯片技术为筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因提供了有效方法,C8ORF4基因可能参与调控肺癌细胞抗失巢凋亡过程。     

环状RNA circ_MTHFD2对mircoRNA-124的调控在肺癌培美曲塞耐药中的作用

目的 探讨circ_MTHFD2调控microRNA 124（miR 124）的表达在肺癌培美曲塞耐药发生过程中的作用。方法 采用高浓度反复间歇诱导法建立肺癌培美曲塞耐药细胞株A549／PEM。通过瘤内注射建立培美曲塞耐药的裸鼠移植瘤模型;采用Lipofectamine脂质体法将miR-124模拟物、miR-124抑制剂及阴性对照转染至A549和A549／PEM细胞,并分为miR-124上调组、miR-124抑制组及阴性对照组;采用CCK-8 法和流式细胞术检测各组细胞的增殖及凋亡情况,比较各组细胞对培美曲塞的敏感性;采用实时荧光定量PCR（QPCR）和基因芯片检测miR 124和环状RNA的表达;通过测序技术检测耐药细胞及耐药裸鼠的肿瘤组织与对照组间环状RNA的表达,预测环状RNA上的miR-124结合位点。结果 亲本细胞A549和耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为 （30.78±1.97）μmol／L和（913.53±14.1）μmol／L,最终获得耐药指数（RI）为29.69±1.49的培美曲塞耐药细胞,命名为A549／PEM。耐药细胞A549／PEM中miR 124的表达显著降低,相比A549细胞,下降约145.952倍;下调miR-124表达的A549细胞对培美曲塞敏感性降低,miR-124抑制组及阴性对照组细胞的IC50分别为（80.45±3.50）μmol／L和（9.94±1.90）μmol／L,差异有统计学意义（P＜0.05）;流式细胞术检测显示miR 124表达上调可以显著诱导A549、A549／PEM细胞的凋亡;通过高通量测序提示在耐药的细胞及组织中环状RNA表达明显上调,表达量上调的circ_MTHFD2可与miR-124结合。结论 circ_MTHFD2可能通过调控miR-124的表达,参与肺癌培美曲塞耐药的发生发展。     

不同肺癌细胞株中VEGFR-2 mRNA表达的实验研究

目的 研究不同非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2） mRNA的表达情况。方法 采用实时荧光定量PCR法检测人肺黏液表皮样癌NCI-H292细胞株、人肺腺癌NCI-H1299细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺巨细胞癌95D细胞株和人肺鳞癌Calu-1细胞株中VEGFR-2 mRNA的表达。结果 Calu-1、NCI-H292、95D、NCI-H1299和A549细胞株中VEGFR-2 mRNA表达依次为1.213±0.134、1.008±0.164、0.754±0.088、0.582±0.171和0.121±0.026,差异有统计学意义（F=31.875, P=0.000）。Calu-1与NCI-H292细胞株间VEGFR-2 mRNA表达无统计学差异（P=0.080）,NCI-H1299与95D细胞株间VEGFR-2 mRNA表达亦无统计学差异（P=0.137）,其余细胞株间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 不同NSCLC细胞株中VEGFR 2 mRNA表达量不同,可能与不同肿瘤细胞的生物学行为有关。     

紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞作用的研究

目的:观察紫杉醇对3种不同p53基因型肺癌细胞的作用。方法:以不同浓度紫杉醇(0.1、1.0、10、100、1 000nmol/L)分别作用肺癌细胞A549、H322、H1299不同时间(4、12、24、48、96 h),实验同时设阴性对照组(不加紫杉醇)和空白对照组(只加细胞培养液)。采用MTT、流式细胞术、Western blotting检测细胞的生长及细胞周期、凋亡、乙酰化微管蛋白、p53蛋白等指标变化。结果:紫杉醇对3株肺癌细胞的生长抑制作用均随着作用时间的延长而增强(P0.05);不同浓度紫杉醇对3株细胞生长的影响也存在差异(P0.05)。3株细胞中A549细胞半数抑制浓度相对较低,但3株细胞间对紫杉醇敏感性的差异无统计学意义(P0.05)。紫杉醇10 nmol/L作用时,3株细胞G2/M期变化趋势基本一致,1 000 nmol/L作用时,A549细胞G2/M期比例与作用时间呈正相关(P0.05),H322和H1299的G2/M细胞于24 h达高峰,作用后期H1299出现异常多倍体;同浓度紫杉醇作用的各株肺癌细胞的凋亡呈时间依赖性,但1 000 nmol/L组诱导的细胞凋亡比10 nmol/L组更晚出现。浓度依赖性实验中,10 nmol/L诱导凋亡比例最高;紫杉醇浓度≤100 nmol/L时,G2/M期比例随浓度增加而增高(P0.05);紫杉醇浓度≥100 nmol/L时,各肺癌细胞株G2/M期比例间的差异无统计学意义。凋亡和G2/M期阻滞无相关性(P0.05)。紫杉醇作用后,A549细胞p53蛋白呈浓度和时间依赖性增加,H322细胞p53蛋白无明显变化。3株细胞乙酰化微管蛋白均较对照组显著上升(P0.05)。结论:紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞生长的抑制作用呈时间依赖性。紫杉醇可增加野生型p53蛋白表达,诱导p53依赖和非p53依赖的两种凋亡途径,p53基因型影响了高浓度紫杉醇对肺癌细胞的周期阻滞作用,但对紫杉醇化疗敏感性无显著影响。     

miRNA-192对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨抑制microRNA-192（miR-192）在非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测人肺腺癌耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549细胞中miR-192的表达水平,A549／DDP细胞转染miR-192抑制剂（inhibitor）和miR-阴性对照（NC）48h后采用qRT-PCR检测转染效率,分别采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测转染48h后A549／DDP细胞对DDP的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,Western blotting检测转染48h后细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。结果 miR-192在A549／DDP细胞中的表达水平高于A549细胞（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor 48h后的A549／DDP细胞miR-192水平低于转染miR-NC者（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor后,A549／DDP细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多、DDP对其半数抑制浓度降低、Bax蛋白水平升高和Bcl-2蛋白水平下降,与转染miR-NC者比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 抑制miR-192能够降低A549／DDP细胞对DDP的耐药性,其作用机制可能是通过增加细胞凋亡以及下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达来实现的。