磷酸酶及张力蛋白同源物基因对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨上调磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN)基因表达对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其作用机制。方法对数期人三阴性乳腺癌ZR-75-细胞株随机分为PTEN组、突变型PTEN(mutated PTEN,M-PTEN)组和对照组,PTEN组、M-PTEN组分别转染人野生型PTEN真核表达质粒(pBP-PTEN)、突变型PTEN质粒(pBP-M-PTEN),对照组未作处理。转染后24、48、72h,MTT法检测3组ZR-75-1细胞生长抑制率,转染后72h,Transwell法检测3组侵袭细胞比率,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测磷酸化局部黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,P-FAK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,P-Akt)表达水平。结果 PTEN组PTEN蛋白相对表达量(8.49±2.92)高于M-PTEN组(0.77±0.24)(P<0.05),对照组无PTEN蛋白表达;转染后24、48、72h,PTEN组细胞生长抑制率[(27.33±21.49)%、(37.20±11.48)%、(48.11±8.14)%]均高于M-PTEN组[(5.98±1.44)%、(6.98±2.84)%、(10.83±3.11)%]和对照组[(1.09±0.33)%、(2.10±0.83)%、(4.20±2.71)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后72h,PTEN组侵袭细胞数目[(24.29±5.82)%]低于M-PTEN组[(56.30±11.84)%]和对照组[(89.29±10.49)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);PTEN组G1期细胞比率[(54.89±2.67)%]低于M-PTEN组[(57.02±1.33)%]和对照组[(63.98±1.09)%],S期细胞比率[(36.56±2.10)%]高于M-PTEN组[(35.98±2.67)%]和对照组[(30.78±0.99)%](P<0.05),G2/G1期细胞比率[(1.85±0.33)%]与M-PTEN组[(1.90±1.10)%]和对照组[(1.91±1.00)%]比较差异均无统计学意义(P>0.05),M-PTEN组G1、S、G2/G1细胞比率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);PTEN组P-FAK蛋白相对表达水平(0.75±0.12)低于M-PTEN组(2.19±0.82)与对照组(3.23±0.62)(P<0.05),P-Akt蛋白相对表达(2.11±0.42)与M-PTEN组(1.83±0.74)和对照组(1.94±0.53)比较差异均无统计学意义(P>0.05);M-PTEN组P-FAK、P-Akt蛋白相对表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PTEN抑癌基因可通过抑制乳腺癌细胞FAK磷酸化,抑制肿瘤细胞复制,进而抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭。     

MTDH基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨异黏蛋白(MTDH)基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭能力的影响。方法在B淋巴瘤细胞Raji中转染MTDH siRNA和siRNA对照,分别命名为MTDH siRNA组和siRNA对照组,将没有转染的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中MTDH表达水平,MTT方法检测细胞增殖和黏附能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平。结果MTDH siRNA细胞中MTDH mRNA和蛋白水平均明显低于对照组和siRNA对照组(P<0.05)。与对照组和siRNA对照组比较,MTDH siRNA细胞增殖和黏附能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力也降低,细胞中Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH基因沉默下调B淋巴瘤细胞增殖能力,抑制B淋巴瘤细胞侵袭和迁移。     

TPX2-siRNA干扰对食管鳞癌EC9706细胞侵袭能力和细胞凋亡的影响

目的观察TPX2基因经特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)作用后对食管鳞癌细胞系EC9706的侵袭能力和细胞凋亡的影响。方法用脂质体lipofectamine 2000介导TPX2-siRNA(siTPX2)转染EC9706细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组。用western blot检测siRNA干扰效率,Boyden chamber法检测细胞侵袭能力,末端转移酶标记技术(TUNEL法)检测细胞凋亡情况。结果有效转染siTPX2 72 h后,siRNA干扰组TPX2蛋白表达水平为0.39±0.12,低于空白对照组1.00±0.01和阴性对照组0.98±0.11,P<0.05;Boyden chamber法检测结果,siRNA干扰组穿膜细胞数为45.30±8.08,少于空白对照组129.40±10.58和阴性对照组121.90±7.83,t分别为8.17和7.90,P<0.05;siRNA干扰组细胞侵袭抑制率为(71.42±9.12)%,明显高于阴性对照组(5.65±3.55)%,t=14.256,P<0.01。TUNEL结果表明,干扰组细胞凋亡指数为18.28±0.35,高于空白对照组4.07±0.26和阴性对照组4.13±0.22,t分别为60.61和53.32,P<0.01。结论 siRNA可以有效抑制EC9706细胞侵袭和转移,促进细胞凋亡,有望作为食管癌治疗的新途径。     

Krüppel样因子4对HeLa细胞生物学行为的影响

目的探讨Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)对HeLa细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 HeLa细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E细胞采用Western blot法检测KLF4蛋白相对表达量。对数生长期人HeLa细胞分为对照组、HeLa/KLF4组和阴性对照组,其中对照组细胞正常培养,不进行转染;HeLa/KLF4组和阴性对照组细胞分别转染人KLF4表达质粒和KLF4空载质粒;采用CCK-8增殖实验检测转染24、48、72 h后3组细胞生长抑制率,采用CCK-8黏附实验检测细胞黏附能力,采用Transwell侵袭和迁移实验检测3组细胞侵袭细胞数和迁移细胞数。结果 HeLa细胞中KLF4蛋白相对表达量(0.22±0.03)低于正常宫颈上皮Ect1/E6E细胞(0.78±0.10)(P0.05),HeLa/KLF4组细胞中KLF4蛋白相对表达量(0.75±0.09)高于阴性对照组(0.32±0.04)和对照组(0.34±0.05)(P0.05),阴性对照组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h,HeLa/KLF4组细胞生长抑制率均高于阴性对照组和对照组(P0.05),阴性对照组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);培养1、2 h后,HeLa/KLF4组细胞黏附能力低于阴性对照组和对照组(P0.05),培养3、4 h后3组细胞黏附能力比较差异无统计学意义(P0.05);培养24 h后,HeLa/KLF4组侵袭细胞数[(28.48±4.33)个]和迁移细胞数[(97.73±17.88)个]明显低于对照组[(69.34±8.58)、(220.68±34.25)个]和阴性对照组[(62.25±6.78)、(208.14±25.83)个](P0.05),对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 KLF4在宫颈癌中可能起抑癌基因的作用,对宫颈癌细胞增殖、生长有抑制效果,并可降低癌细胞的黏附能力、侵袭和迁移能力,KLF4有可能成为宫颈癌发生、发展研究的新靶点。     

同源盒A13在胃癌组织中表达对SGC-7901细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨胃癌组织及癌旁组织中同源盒A13(homeobox gene A13,HOXA13)表达差异,及下调胃癌SGC-7901细胞HOXA13基因表达对细胞增殖和侵袭能力的影响。方法取109例胃癌患者手术切除的胃癌组织和癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测HOXA13蛋白表达;取对数生长期SGC-7901细胞分为转染组(转染siRNA-HOXA13)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作任何处理),采用MTT法检测转染12、24、48、72、96h时细胞增殖能力,Transwell法检测转染后培养48h时细胞侵袭能力,Western blot法检测转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist、E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果胃癌组织HOXA13蛋白阳性表达率(75.23%)高于癌旁正常组织(33.94%)(P0.05);HOXA13蛋白阳性表达率在进展期胃癌(82.98%)、低分化程度(84.93%)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(86.27%)、有淋巴结转移者(84.38%)均高于早期胃癌(26.67%)、中高分化程度(55.56%)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(65.52%)、无淋巴结转移者(62.22%)(P0.05),在性别、年龄、肿瘤直径上差异均无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养24、48、72、96h时吸光度值低于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时侵袭细胞数[(97.14±10.03)个]均较阴性对照组[(115.39±5.77)个]和空白对照组[(125.11±12.45)个]少(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist和Vimentin蛋白表达(0.24±0.05、0.34±0.07、0.36±0.04)均低于阴性对照组(0.87±0.11、0.75±0.02、0.75±0.07)和空白对照组(0.88±0.05、0.76±0.05、0.72±0.06)(P0.05),E-cadherin蛋白表达(0.67±0.08)高于阴性对照组(0.33±0.06)和空白对照组(0.35±0.04)(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论胃癌组织中HOXA13蛋白呈高表达,其表达程度与肿瘤恶性程度有关;下调SGC-7901细胞HOXA13基因表达可抑制细胞增殖和侵袭能力。     

沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响

目的探讨营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响。方法复苏培养人脑胶质瘤U251细胞,建立转染小干扰RNA(siRNA)的NAF1组(si-NAF1组)、阴性对照组(si-NC组)、未转染siRNA对照组(control组),采用CCK-8实验检测细胞增殖能力、平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力、Transwell法观察各组细胞侵袭能力变化。结果与control组比较,NAF1-siRNA干预U251细胞后,si-NAF1组NAF1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05),其增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平降低,细胞增殖能力下降,克隆形成能力明显减弱,迁移能力明显降低,穿过Transwell膜的细胞数量明显减少(P均<0.05)。si-NC组与control组各项结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染siRNA后NAF1表达下降,进而下调PCNA水平,抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖能力;同时MMP-9蛋白表达水平下降,抑制U251细胞的迁移和侵袭能力。     

小干扰RNA抑制成纤维细胞激活蛋白3的表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制成纤维细胞激活蛋白3(fibroblast activation protein 3,FAP3)基因表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响。方法:采用流式细胞术从肺癌细胞株A549中分选出CD44+/CD133+的肺癌的肿瘤干细胞(cancerstem cells,CSCs)。将肺癌CSCs分为3组:空白对照组(不转染任何质粒)、siRNA-FAP组(转染靶向沉默FAP3表达的siRNA质粒)、阴性对照组(转染包含随机序列的siRNA质粒)。采用MTT比色法检测靶向FAP3表达的siRNA(siRNA-FAP3)转染12、24、48和72h后对细胞增殖的影响;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测转染72h后细胞株中FAP3、Ki67的mRNA和蛋白质的表达情况;采用软琼脂克隆集落形成实验检测siRNA-FAP3对肺癌CSCs侵袭能力的影响。结果:转染48h和72h后,siRNA-FAP3组的细胞增殖抑制率[(24.67±1.08)%,(53.98±3.75)%]大于阴性对照组[(3.76±0.88)%,(4.53±1.01)%]及空白对照组[(2.34±0.41)%,(3.28±0.65)%],差异均有统计学意义(P分别<0.05和0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67基因的mRNA表达水平(0.32±0.06,0.18±0.02)显著低于阴性对照组(1.03±0.12,0.99±0.17)和空白对照组(1.02±0.09,0.97±0.11),差异有统计学意义(P<0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67蛋白表达水平(0.16±0.05,0.25±0.09)显著低于阴性对照组(0.49±0.26,0.47±0.13)和空白对照组(0.59±0.27,0.63±0.22),差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-FAP组细胞克隆形成率[(13.09±5.21)%]显著低于阴性对照组[(77.59±8.29)%]和空白对照组[(83.86±10.11)%],差异有统计学意义(P<0.01)。结论:转染siRNA可有效抑制肺癌CSCs中FAP3蛋白的表达,并且还可抑制CSCs的体外增殖和侵袭能力。     

短发夹核糖核酸沉默EZH2基因对人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨短发夹核糖核酸（sh RNA）对高表达EZH2的人胶质瘤细胞株U251增殖和侵袭的影响。方法构建针对EZH2的sh RNA重组质粒,采用电穿孔的方法转染至U251细胞中,分为对照组、control-sh RNAGFP空载体转染组和EZH2-sh RNA重组质粒转染组。分别通过逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测各组细胞EZH2基因和蛋白的表达,以噻唑蓝法测各组细胞的增殖活性,蛋白质印迹法检测各组细胞的EZH2蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞侵袭力。结果对照组、control-sh RNA-GFP空载体转染组、EZH2-sh RNA重组质粒转染组U251细胞EZH2基因的表达分别为1.13±0.05、1.15±0.05、0.19±0.02,U251细胞EZH2蛋白的表达分别为1.03±0.03、0.97±0.06、0.20±0.02,转染后24 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.31%、100.03%±9.35%、60.13%±3.15%,转染后48 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.13%、99.58%±9.27%、53.01%±3.14%,重组质粒转染组较另两组均明显下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;重组质粒转染组转染48 h后细胞磷酸化蛋白激酶B和磷酸化叉头框蛋白O1水平降低、细胞周期蛋白D1表达减少、p27蛋白表达增多,差异有统计学意义（P〈0.05）。Transwell小室侵袭实验显示侵袭至Transwell小室滤膜下表面的细胞数在EZH2-sh RNA重组质粒转染组[（46.00±2.82）个]低于对照组[（60.67±5.71）个]和control-sh RNA-GFP空载体转染组[（61.00±2.48）个],差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 EZH2基因沉默能有效抑制人胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,为深入研究EZH2在胶质瘤中作用提供了研究基础。     

SNRPA对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及Snail1信号通路的影响

摘要：目的?检测小核核糖核蛋白多肽A(SNRPA)在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达，分析SNRPA调控锌指转录因子1(Snail1)对人胃癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响。方法?通过对GAPIA数据库进行检索以及western blot验证，以确定SNRPA在胃癌组织中的表达情况，并对患者临床病理参数进行统计学分析。进一步检测胃癌细胞系AGS、HGC27、SGC7901、BGC823和MGC803中SNRPA蛋白及mRNA的表达水平。在胃癌细胞系AGS和SGC7901中分别转染SNRPA siRNA和SNRPA过表达质粒，采用CCK8及EdU细胞增殖试验检测转染后细胞的增殖活性；Transwell细胞迁移和侵袭试验检测细胞迁移能力；western blot检测相应蛋白质的表达；敲减Snail1后进一步验证SNRPA调控Snail1介导胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结果?SNRPA在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。此外，在AGS细胞系中SNRPA的表达水平最高，而在SGC7901细胞系中SNRPA的表达水平最低。在AGS细胞系中，敲减SNRPA后，其细胞增殖活性显著低于阴性对照组(P<0.05)，且细胞迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)，Snail1蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。在SGC7901细胞系中，转染SNRPA过表达质粒后，其增殖活性明显高于阴性对照组(P<0.05)，细胞迁移和侵袭能力明显增高(P<0.05)，Snail1蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)。在AGS细胞系中，转染Snail1 siRNA后，其细胞增殖活性明显低于阴性对照组(P<0.05)，细胞迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)。而在SGC7901细胞系中，SNRPA过表达质粒和Snail1 siRNA共转染后，与对照组相比，其细胞增殖活性、细胞迁移和侵袭能力差异均无统计学意义(P>0.05)。结论?SNRPA在胃癌组织中高表达；SNRPA通过上调Snail1表达促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。