农杆菌转化后丹参植株再生

用发根农杆菌15834,LBA9402株和根癌农杆菌C58株感染丹参无菌苗,完成质粒转化后诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化后的丹参再生植物,再生植物移植到土壤中能够成活。用发根农杆菌转化后的再生植物的具有节间缩短,植株矮化、地下部毛状须根发达等特征。用根癌农杆菌转化后的再生植物生长旺盛,地上部分较原植物高大,根系发达,根产量和丹参酮含量都高于原植物。     

光照和植物生长物质对宁夏枸杞正常根和发状根离体生长的影响

目的:探索光照和植物生长物质对宁夏枸杞无菌苗正常根和发状根离体生长的影响,建立离体根的最佳培养体系。方法:以宁夏枸杞无菌苗正常根和发根农杆菌A₄诱导叶外植体再生的发状根为材料,观察根切段在光照、植物生长物质种类和含量等不同的培养条件下的生长(长长、侧根形成)情况。结果与结论:MS培养基中添加植物生长物质(IAA,IBA,NAA)能够诱导宁夏枸杞正常根切段的生长和分枝形成,而1 mg.L^-1IBA的存在最适合于正常根的长期离体培养。在无激素培养基上,光照能促进Ⅱ型发状根的长度增长和分枝侧根,却不利于Ⅰ型发状根的生长。在添加的3种外源植物生长物质(IAA,IBA,NAA)中,低含量的IAA更适合于Ⅰ型发状根的增长培养;而在促进Ⅱ型发状根的增长和侧根形成方面,1 mg.L^-1IBA的作用最强。随着植物生长物质添加含量的增加,Ⅱ型发状根的愈伤组织化程度也加大,同时也抑制了从发状根或其形成的愈伤组织上形成新的分枝侧根。     

青嵩等六种药用植物发状根的研究

青嵩等六种药用植物发状根的研究上海中医药大学黄炼栋，胡之璧，章国瑛，吴耀平（２０００３２）关键词：发根农杆菌，发状根，丹参酮植物发状根是发根农杆菌Ｒｉ质粒中的Ｔ－ＤＮＡ插入到植物细胞基因组内而得到的一种表现型。近年来，探索用发状根培养物来生产有用活性...     

植物外源激素对丹参生长和丹参酮类物质积累的影响

目的研究植物外源激素赤霉素(GA3)和吲哚乙酸(IAA)对丹参生长和丹参酮类物质积累的影响。方法采用温室石英砂盆栽试验与室内分析相结合的方法。结果单独施用GA3有利于丹参地上部分生物量的增加,但对地下部分生物量表现一定抑制作用;施用低浓度和高浓度GA3均有利于3种丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA)的累积,施用中等浓度GA3则不利于3种丹参酮的累积。单独施用IAA对丹参地上部分和地下部分生物量的影响呈现先升后降趋势,但统计学差异不显著,且对株高、根长的影响亦不显著;总体来看,施用低质量浓度IAA(0.5mg/L)有利于丹参根中3种丹参酮的累积,但随着IAA处理浓度增加,仅隐丹参酮量有所增加,而丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA量反而下降。两种激素配施时,低浓度GA3与低浓度IAA组合处理对丹参的生长表现出显著促进作用,并能显著提高丹参根中3种丹参酮的量。结论施用适量的植物外源激素GA3和IAA能够促进丹参的生长和丹参根中3种丹参酮类物质的积累。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

车前的组织培养

报道了车前外植体的愈伤组织诱导及其植株再生的研究结果。单独的外源生长素2，4－D适宜诱导外植体脱分化产生愈伤组织，只有单独添加6－BA时，才适宜再生芽的分化，当NAA与6－BA配合添加培养基中，则有利于再生根的繁茂生长，从而形成完整的再生植株。     

长春花毛状根再生植株的获得及抗癌生物碱的产生

目的建立长春花转基因毛状根再生植株快速繁育体系,获得生物碱量提高的长春花再生植株。方法研究外源植物生长调节剂对长春花毛状根愈伤组织诱导、不定芽分化、不定根分化和再生植株移栽的影响,采用HPLC法测定长春花再生植株生物碱量,并采用定量PCR技术分析目的基因的表达情况。结果转基因长春花毛状根愈伤组织诱导和不定芽诱导的最佳培养基均是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L,不定根分化的最适培养基是1/2 MS+NAA 0.3 mg/L。采用炼苗的改进方法可使长春花再生植株的移栽成活率达90%。HPLC分析结果表明,长春花再生植株中长春碱、长春新碱和阿吗碱量分别比对照提高4.0、5.8、1.8倍,其中,优良单株OG30-3的长春新碱和长春碱量比对照提高7倍和10倍。定量PCR分析结果表明,转基因植株orca3基因和g10h基因的表达量比非转基因植株的高。结论转基因长春花毛状根再生植株可促进抗癌生物碱的产生。     

基于高通量测序的紫花丹参与白花丹参根际细菌群落结构研究

根际细菌在提高植物营养吸收、促进植株生长及提高植物根系抗病性等方面起着重要作用。该研究以同一地块紫花丹参与白花丹参根际细菌为研究对象,采用16S r DNA高通量测序技术研究其群落结构特征与差异性物种,并分析其优势菌群的功能。结果表明,紫花丹参根际的鞘脂杆菌目、鞘脂单胞菌目、亚硝化单胞菌科等优势菌群丰度显著高于白花丹参。丹参根际优势促生细菌的功能主要集中于促进根际土壤养分的转化、降解自毒物质以及提高植物抗环境胁迫能力。该研究首次比较分析了紫花丹参与白花丹参根际细菌群落结构与差异性物种组成,为进一步研究丹参根际微生态过程提供了科学依据。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对红景天发状根的转化

目的:构建烟草根特异性启动子植物表达载体并转入红景天发状根中。方法:以双元表达载体pCAM-BIA1301为基础,用烟草根特异性启动子TobRB7和葡萄糖基转移酶基因UGTR分别取代双元表达载体中的CaMV35S启动子和GUS基因,从而获得了烟草根特异性启动子驱动葡萄糖基转移酶基因的表达载体,命名为pCA-Tob7:UGTR。通过根癌农杆菌介导法转化红景天发状根。结果:成功地获得了转基因阳性发状根,即表明所构建的表达载体已成功整合到了红景天发状根基因组中。结论:首次获得了根特异性启动子植物表达载体并整合到了红景天发状根基因组中,为进一步研究特异性启动子对红景天苷合成的调控作用奠定了基础。     

水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定

实验采用6种发根农杆菌R1601,R15834,R1000,A4,R1025,R1感染水飞蓟植体,诱导水飞蓟发状根及其水飞蓟宾的产生。6种发根农杆菌均能诱导水飞蓟产生发状根,A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力。实验通过侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发状根产生的条件,确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的增殖。经过PCR分子鉴定,发根农杆菌中的DNA质粒成功的整合到转化根的基因组中。使用液相色谱测定了水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2.5倍。实验所建立的水飞蓟发状根培养系统,为研究水飞蓟发状根大量培养生产水飞蓟宾奠定了基础。     

白藜芦醇合酶基因的克隆及丹参的转化

目的为探索利用分子生物学技术培育新型药用植物的新途径,将外源的白藜芦醇合酶(RS)基因导入到丹参中表达,以改善或增加丹参的效用。方法根据已公布的核苷酸序列,利用引物悬挂延伸法,经过3次扩增,最终从葡萄基因组DNA中获得完整的RScDNA基因序列;以质粒pBin438为基础,构建含有RS目的基因的组成型植物表达载体。在根癌农杆菌介导下,利用叶盘法转化丹参,进而通过PCR、PCR-Southern杂交对不同的转基因植株进行筛选与检测。结果总共得到了45棵卡那霉素抗性植株,经PCR和PCR-Southern杂交检测,确定葡萄RS基因已整合到部分转基因丹参苗的基因组中。结论成功建立了白藜芦醇合酶基因转化丹参的体系,并获得了转基因植株。     

人参Ri质粒转化及代谢产物对HepG2细胞的作用

目的:发状根生产的次生代谢产物含量比植物自身合成的含量高几倍甚至几十倍,利用人参发状根可以生产大量人参皂苷,并有效的抑制癌细胞的增值。方法:通过正交试验设计筛选人参发状根诱导的条件,通过发状根生物积累量和皂苷含量的测定确定培养条件,然后利用MTT法测定了人参皂苷对HepG2细胞的影响。结果:本实验优化了人参发状根的最佳诱导条件,吸光度A 0.6,侵染时间为10 min,预培养时间为3 d,筛选出发状根的最佳培养条件,MS培养基,pH 6.1,24℃培养时,发状根的生物积累量和皂苷含量均较高,采用人参总皂苷对肝癌细胞HepG2的抑制效果进行研究,证实人参总皂苷对HepG2的抑制率与给药浓度呈正相关。结论:筛选出最适的人参发状根诱导及培养条件,不同部位的总皂苷对肝癌细胞HepG2的增殖均具有抑制作用。     

植物生长调节剂对丹参药材产量和品质的影响

为了解植物生长调节剂对丹参药材产量和品质的影响。研究采用田间试验的方法,于7-8月在丹参植株上喷施植物生长调节剂,分析对丹参产量、有效成分和抗氧化活性的影响。结果表明壮根灵可使分根繁殖的丹参显著增产,多效唑可使种苗繁殖的丹参显著增产;壮根灵和多效唑对丹参有效成分含量的影响不显著,但是二者可以极显著的降低丹参的抗氧化活性。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

丹参毛状根不同培养时期有效成分的积累研究

丹参是唇形科草本植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的根及根茎,具有活血祛瘀,凉血清心,养血安神的功效,是临床常用的中药。毛状根是农杆菌中R i质粒的一段DNA嵌入植物基因组中并表达的结果,许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长出大量毛状根。由于其生长速度快,不需外源植     

复合种植对丹参生长及药材品质的影响

通过设置丹参与决明、辣椒、紫苏、玉米4种混作复合种植群体,分析4种搭配植物对丹参植株形态、根中干物质积累量、活性成分含量及体外抗氧化活性的影响;并通过根系隔离处理,初步探索4种搭配植物对丹参产量与质量形成的作用机制,从中选择适于与丹参建立复合群体的搭配植物,为构建丹参高效复合种植模式提供依据。结果表明:不同复合群体中丹参的植株形态、根中干物质积累量、活性成分含量及体外抗氧化活性均存在显著性差异;决明、玉米与丹参复合种植均不利于丹参的生长及产量的形成;紫苏与丹参复合种植显著促进了丹参的生长,但显著降低了丹参的品质;辣椒与丹参复合种植使丹参的产量和品质均有显著性提高。因此,决明、玉米、紫苏和辣椒4种植物中,茄科的辣椒是与丹参构建复合种植群体的最佳搭配物种。     

不同激素诱导丹参幼根生长试验

丹参Salvia miltiorrhiza,别名紫丹参、血参,以根入药,有活血化瘀、除烦安神、调经止痛等功能。对治疗冠心病、慢性肝炎、早期肝硬化等疾病有良好的效果。目前全国各地均有栽培。由于丹参种子细小,要求温度、湿度条件较高,较难萌发,常用分根和扦插繁殖。丹参根在受伤或折断情况下,折断面能产生不定芽,所以多用根繁殖。丹参幼根生长情况直接影响最终产量,而影响最大的是丹参新根的长度和数量。为了增加丹参新根的数量和长度,并促进植株生长,最终提高丹参的产量,特作了激素诱导试验。     

渐危药用植物珊瑚菜胚状体途径再生植株的研究

目的:研究离体条件下珊瑚菜种子休眠的原因,建立胚状体途径再生植株的方法。方法:研究离体条件下胚乳因素和外源激素在解除珊瑚菜种子休眠过程中的作用,以及激素浓度对胚性愈伤组织诱导及胚状体再生植株的影响。结果:保留1/3胚乳的珊瑚菜种子萌发率最高,可以达到31%。而TDZ,6-BA,GA3处理不仅对解除珊瑚菜种子休眠的作用不大,同时容易导致出现畸形苗。在附加1.0 mg.L-1 2,4-D的MS培养基上,胚性愈伤的诱导率可以达到57%。将培养20 d左右胚性愈伤组织转入MS培养基上40 d左右就可分化形成子叶期胚状体,然后再继代培养20 d即可得到再生植株。结论:建立一套有效的珊瑚菜再生植株体系。     

基于响应面法对丹参毛状根诱导条件的优化研究

目的:应用响应面法优化丹参毛状根诱导条件,提高其诱导率。方法:采用发根农杆菌ATCC15834侵染丹参无菌苗获得毛状根,在单因素实验的基础上,利用Box-Benhnkcn设计和响应面分析方法对丹参毛状根诱导过程的培养条件(叶片大小、农杆菌活力、侵染时间、共培养时间、抗生素浓度)进行分析,优选最佳培养条件。结果:丹参毛状根在无外源激素的MS培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根的最优培养条件为:叶片大小0. 8cm2,农杆菌OD600为1. 0,共培养时间2d,农杆菌侵染时间5min,头孢噻吩浓度400ng/L。在此条件下,丹参毛状根的诱导率为69. 8%。结论:该研究优化了丹参毛状根的培养条件,为丹参的进一步开发利用提供了依据。     

茉莉酸甲酯调控下人参发状根皂苷合成相关基因表达的研究

通过外源添加茉莉酸甲酯(MeJA),研究其调控液体培养条件下人参发状根中皂苷生物合成途径相关酶基因在诱导子作用时表达情况。以四年生吉林人参主根诱导的人参发状根无性系为材料,利用香草醛-硫酸比色法测定MeJA处理前后人参发状根的总皂苷含量;同时,利用荧光实时定量PCR测定MeJA处理前后人参发状根中鲨烯合成酶(squalene synthase,SQS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)、氧化鲨烯环化酶(oxidized squalene cyclase,OSC)、达玛烷二醇合成酶(dammarenediol synthase,DS)、β-香树脂合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)和环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的相对表达量。结果表明:获得MeJA添加到人参发状根中最佳添加浓度为6×10~(-4)μmol·L~(-1)、添加时间为22 d、作用时间为5 d;MeJA的添加可以提高人参发状根中过氧化物酶(PPD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(PPD)的酶活性;经过MeJA处理后人参发状根中人参皂苷生物合成途径的SQS,SQE,OSC,DS,β-AS基因的表达变化均有显著提高,然而CAS基因的表达变化不显著。因此说明在添加MeJA处理后,皂苷生物合成途径中SQS,SQE,OSC,DS,β-AS基因表达情况与PPD,CAT,PPO的酶活性的变化趋势也相一致。