喹乙醇对HepG2细胞抗氧化系统的影响

目的：观察喹乙醇对人肝癌细胞（HepG2）抗氧化系统的影响,探讨喹乙醇诱导HepG2细胞氧化性损伤的机制。方法：分别将0、200、400、800μg/ml的喹乙醇作用于HepG2细胞24h后,检测各组细胞内抗氧化酶/物的变化;另设800μg/ml的喹乙醇作用于HepG2细胞3h后,再用超氧化物歧化酶（SOD）（100μg/ml）、过氧化氢酶（CAT）（100μg/ml）及SOD（100μg/ml）＋CAT（100μg/ml）分别作用细胞3h的各实验组,采用分子探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFDA）检测各组处理后细胞内活性氧含量的变化。结果：不同浓度的喹乙醇作用HepG2细胞24h后,细胞总ATPase、Na＋K＋-ATPase及Ca2＋Mg2＋-ATPase和细胞内SOD、谷胱甘肽（GSH）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性随喹乙醇浓度的升高而下降（P〈0.05或P〈0.01）,且具有一定的剂量-效应关系,细胞内CAT活性较对照组下降（P〈0.01）,但无剂量-效应关系,而细胞内丙二醛（MDA）水平随喹乙醇浓度的升高而增加（P〈0.05或P〈0.01）,且呈一定的剂量-效应关系。经喹乙醇（800μg/ml）处理细胞后,再分别用CAT、SOD及SOD＋CAT处理的各组,其ROS含量与单纯喹乙醇（800μg/ml）组相比分别减少80%（P〈0.01）、40%及95%（P〈0.01）。结论：喹乙醇可使体外培养HepG2细胞的抗氧化系统受到一定的破坏,且产生的ROS形式以H2O2为主。     

Nrf2/ARE信号通路在槲皮素抑制异烟肼诱导的肝细胞线粒体氧化损伤中的作用

目的：探讨核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）信号通路在槲皮素抑制异烟肼（INH）诱导的L-02细胞线粒体氧化损伤中的作用。方法：将L-02细胞随机分为阴性对照组、INH组（10 mmol/L INH）、单独槲皮素组（50 μmol/L槲皮素）、槲皮素保护组（10 mmol/L INH+50 μmol/L槲皮素）,各组细胞处理24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞存活率;荧光探针DCFH-DA检测细胞线粒体活性氧（ROS）水平;比色法测定细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性,评价细胞线粒体氧化损伤状态。Western blot检测Nrf2、血红素氧合酶1（HO-1）蛋白表达水平,评价细胞内Nrf2/ARE信号通路的变化。结果：与阴性对照组比较,INH组细胞存活率显著降低（P < 0.01）,线粒体ROS水平和MDA含量显著升高（P < 0.01）,GSH含量及SOD活性明显降低（P < 0.01）;与INH组相比较,槲皮素保护组细胞存活率明显增加（P < 0.01）,线粒体ROS水平和MDA含量显著减少（P < 0.01）,GSH含量及SOD活性明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。INH组细胞质中HO-1蛋白及细胞核中Nrf2蛋白表达较阴性对照组明显增加（P < 0.01）;槲皮素保护组细胞质中HO-1蛋白及细胞核中Nrf2蛋白表达明显高于INH组（P < 0.01）。结论：槲皮素能够抑制INH诱导的肝细胞线粒体氧化损伤,这可能与槲皮素对Nrf2/ARE信号通路的活性调节相关。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中细胞内抗氧化蛋白和活性氧水平研究

目的：研究α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化过程中细胞内主要抗氧化蛋白的表达和活性氧（ROS）水平以及DNA双链断裂水平的变化。方法：选择BEP2D细胞、RH22细胞和BERP35T-1细胞,采用Western blot检测细胞内抗氧化蛋白过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）以及铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和锰-SOD（Mn-SOD）的表达;采用SOD测定试剂盒检测细胞内总SOD（T-SOD）、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD酶活力;荧光探针标记结合流式细胞仪检测细胞内基础H_2O_2和O_2~（？）水平;中性彗星电泳法检测细胞内DNA双链断裂水平。结果：与BEP2D细胞相比,RH22和BERP35T-1细胞内抗氧化蛋白CAT和GPX1表达下调（P〈0.05或P〈0.01）,GPX3、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达增强（P〈0.05或P〈0.01）;且T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活力均显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。RH22和BERP35T-1细胞内基础O_2~（？）水平低于BEP2D细胞,基础H_2O_2和DNA双链断裂水平则高于BEP2D细胞（P〈0.05）。结论：细胞内氧化/抗氧化失衡形成氧化压力,促进DNA氧化损伤和基因组不稳定性,可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化的机制之一。     

过氧化氢对不同时相HepG2细胞氧化作用的研究

背景与目的:研究过氧化氢(H2O2)对不同时相HepG2细胞作用的选择性,以进一步探讨H2O2:诱导肿瘤细胞凋亡的机制.材料与方法:以胸腺嘧啶核苷(TdR)阻断法获得不同细胞周期时相的同步化细胞,分别加入800 μmol/L的H2O2作用3 h,并检测各组细胞的丙二醛(MDA)含量、黄嘌呤氧化酶(XOD)和5'核苷酸酶(5'NT)的活性及抗羟自由基(抗·OH)和抗超氧阴离子自由基(抗O2)的活性.结果:经H2O2处理的各组MDA含量和XOD、抗·OH、抗O2活性显著高于对照组,其差异均具有统计学意义(P均＜0.01),5'NT活性低于对照组(P＜0.01).与未同步化组比较,同步化于S期和G2/M期的细胞MDA含量和XOD、5'NT、抗·OH和抗O2活性显著升高,其差异均具有统计学意义(P均＜0.01),而同步化于G1期的细胞MDA含量、XOD、5'NT和抗O2-活性显著降低,差异均具有统计学意义(P均＜0.01).结论:H2O2作用同步化HepG2细胞后,代谢产生自由基的酶活性,脂质过氧化产物含量以及抗氧化水平均表现出细胞周期特异性,这可能是过氧化氢对不同时相HepG2细胞损伤作用不同的原因.     

葡萄籽原花青素对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4损伤的保护作用

目的 研究葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract, GSPE）对顺铂（Cisplatin, cDDP）诱导的小鼠睾丸支持细胞TM4损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养正常小鼠睾丸支持细胞TM4,MTT法测定GSPE、cDDP分别对TM4细胞生长的影响以及GSPE对cDDP诱导的TM4细胞损伤的保护作用,硫代巴比妥酸法测定细胞内丙二醛（MDA）含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）含量,二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽（GSH）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量,硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）、一氧 化氮合酶（NOS）含量,同时观察细胞形态学变化。结果 GSPE可显著增强TM4细胞存活率,抑制cDDP对TM4细胞的毒性作用,降低细胞内MDA、NO、NOS含量,减缓SOD、GSH、GSHPx 耗竭,对cDDP诱导TM4细胞抗氧化酶活力降低和脂质过氧化物含量升高有显著抑制作用（P ＜0.01）。结论 GSPE能有效抑制cDDP诱导的TM4细胞氧化性损伤,其机制可能与GSPE的抗氧化作用相关。     

2-DG对肺腺癌A549细胞增殖的影响及其相关机制

目的:探讨2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)对肺腺癌A549细胞增殖的影响及其相关机制.方法:不同浓度的2-DG与抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)单独及联合处理A549细胞,CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞生存率;DCFH-DA (2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate)染色检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化;比色法检测A549细胞内氧化型谷胱甘肽占总谷胱甘肽含量的百分比;实时荧光定量PCR检测细胞内SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px) mRNA的转录情况.结果:2-DG可以显著抑制A549细胞的生长,同时伴随着细胞内ROS产生增多和氧化型谷胱甘肽所占的百分比升高.2-DG干预后,细胞内CAT和GSH-Px mRNA表达水平上调,而SOD mRNA的表达水平未出现明显变化.A549细胞经NAC和CAT预处理后,2-DG的抗肿瘤作用明显减弱,而特异性氧自由基清除剂SOD对2-DG的抗肿瘤作用没有明显影响.结论:2-DG能够抑制A549细胞增殖,其机制可能与诱导ROS的生成,尤其是H2O2的生成有关.     

2-TeCD对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞损伤影响的研究

目的:探讨谷胱甘肽过氧化物酶模拟物2-TeCD对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤影响.方法:用不同浓度的H2O2作用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,确定其半数致死浓度(IC50).检测2-TeCD对H2O2损伤细胞的细胞生存率、脂质过氧化物含量(MDA)和DNA裂解率.结果:H2O2对SH-SY5Y细胞的IC50为0.208 mmol/L;0.2 mmol/L的H2O2处理后SH-SY5Y细胞生存率为对照组的52.67％,TeCD保护H2O2损伤SH-SY5Y细胞的有效浓度为10 μmol/L; 10和20 μmol/L的2-TeCD可降低SH-SY5Y细胞中MDA含量,并降低DNA裂解率.结论:2-TeCD对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞具有较好保护效果,可成为潜在的抗氧化药物.     

淫羊藿甙促进活性氧表达诱导甲状腺癌B-CPAP细胞凋亡的研究

背景与目的：淫羊藿甙(icariin，ICA)，是从檗科淫羊藿属植物中提取的重要黄酮类活性化合物。研究表明，ICA对肺癌和胃癌等肿瘤有很好的抑制作用，有望开发为疗效较好的抗肿瘤药，但其作为有前景抗肿瘤药物在甲状腺癌中的研究较少，其作用机制罕见报道。该研究拟探究不同浓度ICA对甲状腺癌B-CPAP细胞系增殖凋亡、细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)及抗氧化酶系统的影响，探究ICA对甲状腺癌活性影响机制是否具有浓度-时间依赖性。方法：采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度ICA对B-CPAP细胞系增殖的影响，采用流式细胞仪技术检测ICA对细胞凋亡及细胞内ROS的影响，采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒检测ICA对细胞内SOD表达影响，采用丙二醛(malondialdehyd，MDA)检测试剂盒检测ICA对细胞内MDA表达的影响，采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测Bcl-2及γ-HA2X蛋白的表达。结果：ICA处理48 h后B-CPAP细胞活性降低，细胞凋亡率上升，呈剂量-时效依赖性(P＜0.01)。ICA 50和200 mg/L处理组ROS生成量依次是对照组(Control组)的(2.12±0.14)倍和(2.41±0.12)倍。ICA促进细胞膜脂质化产物MDA的累积，降低抗氧化酶SOD活性，活性比Control组下降(9.35±1.45)%和(21.5±1.52)%。ICA 200 mg/L处理组抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(13.64±1.71)%。结论：ICA具有良好的抑制甲状腺癌B-CPAP细胞活性的作用，并呈现剂量依赖性，其主要作用途径可能是促进细胞内ROS高表达，抑制SOD表达，抗凋亡蛋白Bcl-2低表达，导致细胞不可逆损伤，从而诱导细胞凋亡。     

肺癌组织中抗氧化酶及氧化代谢物变化的定量分析

背景与目的 抗氧化酶与肿瘤的关系逐渐受到重视.通过对113例原发性肺癌患者手术切除肿瘤组织和肿瘤远端正常肺组织的抗氧化酶和氧化代谢物及SOD mRNA及其蛋白表达量的测定,观察肺癌组织氧化/抗氧化状态的特点,为补充或完善肺癌发生和发展机制提供一定的依据.方法 应用比色法测定肺癌组织抗氧化酶活性和氧化代谢物[包括:总超氧化物歧化酶(TSOD) (包括MnSOD和CuZnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)]的含量,采用半定量PCR和Western Blot法测定患者组织中MnSOD和CuZnSOD的mRNA和蛋白表达量.结果 ①与肿瘤远端正常肺组织相比,肺癌组织中的TSOD、CuZnSOD、GPx活性增高,H2O2、MDA降低(P＜0.05或P＜0.01);②肺腺癌组织中的氧化代谢物H2O2、MDA高于肺鳞癌组织(P＜0.05或P＜0.01);③与肿瘤远端正常肺组织相比,肺癌组织中MnSOD mRNA和蛋白表达量降低,CuZnSOD mRNA和蛋白表达量增高(P＜0.01).结论 肺癌组织存在着氧化/抗氧化失衡.SOD的异常表达水平均出现细胞异常生长,提示氧化/抗氧化失衡与肺癌的发生和发展存在一定的关系.     

p63和p73的表达与苯并(a)芘致H1299和16HBE细胞DNA损伤的关系

背景与目的:研究p63与p73的mRNA表达与BaP致人肺腺癌细胞(H1299)和人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤的关系.材料与方法:分别用不同浓度BaP(8、16、32、64和128 μmol/L)处理H1299和16HBE两种细胞,在4 h和12 h时,使用相应的生化检测试剂盒分别测定细胞裂解液中MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性,用qRT-PCR方法测定处理后细胞的p53、p63、p73、mdm2和mdm4的mRNA水平;用Comet实验评价细胞DNA损伤程度.结果:16、32和64 μmol/L BaP处理4 h时,两种细胞MDA水平显著性升高,SOD和GSH-Px活性显著性下降(P<0.05).用BaP处理H1299和16HBE细胞4 h和12 h时均观察到DNA损伤随浓度增加而加重,且呈剂量-效应关系(P<0.01),mdm2、mdm4 mRNA表达水平升高(P<0.01).不过仅在12 h时p53基因mRNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01).在4 h和12 h时点,仅在H1299细胞的p63和p73 mRNA表达增加(P<0.05). 结论:在BaP致p53缺失的H1299细胞的DNA损伤中,BaP可能通过不依赖p53信号通路激活了p63和p73 mRNA的表达.     

H2O2对HL-60细胞DNA中8-羟基鸟嘌呤含量影响的研究

目的与方法：本文采用气相色谱／氢火焰离子检测器（ＧＣ／ＦＩＤ）和气相色谱－质谱仪选择性离子检测器（ＣＧＣ／ＭＳ－ＳＩＭ）探讨Ｈ２Ｏ２致ＨＬ－６０细胞氧化损伤时ＤＮＡ中氧化修饰碱基８－羟基鸟嘌呤（８－ｏｈ－Ｇ）含量的变化,观察ＨＬ－６０细胞脂质过氧化程度和细胞内还原型谷胱甘肽／氧化型谷胱甘肽（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）比值的变化。结果：结果显示Ｈ２Ｏ２可使ＨＬ－６０细胞丙二醛（ＭＤＡ）含量增高（Ｐ〈０．０１     

线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO对氮芥诱导BEAS-2B细胞损伤的影响

目的: 探讨线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO对氮芥(HN2)诱导人支气管上皮细胞系BEAS-2B的影响。方法: BEAS-2B细胞分为正常对照组、Mito-TEMPO对照组、HN2染毒组和Mito-TEMPO干预组,其中正常对照组和Mito-TEMPO对照组分别给予含DMSO(体积分数为0.1%)和Mito-TEMPO(100μmol/L)的无血清培养基处理26 h,HN2染毒组给予含DMSO的无血清培养基预处理2 h,然后给予HN2(8μmol/L)染毒24 h,Mito-TEMPO干预组给予Mito-TEMPO(100μmol/L)预处理2 h,然后HN2(8μmol/L)和Mito-TEMPO(100μmol/L)共处理24 h。分别采用CCK-8法检测细胞活性,速率法检测细胞培养基上清乳酸脱氢酶(LDH)活性,倒置显微镜观察细胞形态,Annexin V/PI探针法流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1探针法检测线粒体膜电位,紫外分光光度法检测细胞匀浆ATP含量,MitoSOX、DCFH-DA、DHE探针法分别检测细胞内线粒体ROS、H2O2及总ROS水平,实时荧光定量PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA表达水平。结果: 与HN2染毒组相比,Mito-TEMPO干预组细胞活性降低了约42.6%(P<0.05),细胞上清LDH水平显著增加(P<0.05),同时伴有异常形态细胞增多,Mito-TEMPO干预组细胞线粒体ROS水平降低了53.6%(P<0.05),细胞内H2O2水平及总ROS水平分别升高了171%和43.4%(均为P<0.05)。Mito-TEMPO干预对HN2染毒导致的细胞凋亡比例、线粒体膜电位、ATP含量、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平等指标改变均无显著影响(P>0.05)。结论: 100μmol/L的Mito-TEMPO干预在HN2染毒BEAS-2B细胞模型中促进了细胞损伤,其机制可能与提高细胞内H₂O₂水平及总ROS水平有关。     

三阴性乳腺癌中ERβ和NF-κB的表达及其相关性

目的:研究三阴性乳腺癌细胞中雌激素受体β（estrogen receptor β,ERβ）和核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表达,初步探讨ERβ和NF-κB的关系。方法:Western blot检测MDA-MB-231细胞中ERβ和NF-κB蛋白的表达。免疫共沉淀法检测MDA-MB-231细胞中ERβ和NF-κB蛋白的相互作用。Western blot 检测转染ERβ后的MDA-MB-231细胞中ERβ表达变化和NF-κB蛋白的表达,以及用免疫共沉淀检测转染后ERβ和NF-κB蛋白表达的关系。结果:MDA-MB-231细胞中ERβ和NF-κB蛋白表达之间无明显相关,但转染ERβ后ERβ表达增加,NF-κB表达降低,二者之间表达呈现明显相关性。结论:MDA-MB-231细胞中ERβ抑制NF-κB 蛋白的表达。     

转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨

】 ObjectivesTo investigate the effects of the CD80 costimulatory molecule expression on the immunogenicity and biological characteristics of poorly immunogenic B16 melanoma cells,explore the relationship between the immunogenicity of tumor cells and cell surface molecules. MethodsHuman CD80 cDNA was transfected into B16 melanoma cells by lipofectin-mediated gene transfer before the expansion of tumor cells were tested by MTT method in vitro;C57BL/6 mice were inculated subcutaneously either mock-transfected B16 cells (B16-neo)or CD80-transfected B16 cells (B16-CD80),then the latency,survival times and tumor mass growth were investigated.The lymphocytes were examined for both proliferation indices (PI) and specific cytotoxic activity by MTT method and improved LDH-releasing method,after syngenic Mixed Lymphocyte tumor cultures (MLTCs). ResultsIn the B16-CD80 cells,in which CD80 expression were detected by SABC method, demonstrated slower growth rate than B16-neo Clles in vivo (P<0.05),though they didn't in vitro. Compared with B16-wt and B16-neo cells,B16-CD80 cells more effectively induced the proliferation of effector lymphocytes and the generation of specific lytic activity against B16-wt cells. ConclusionsThe CD80 (B7-1) expression in poorly immunogenic tumor cells can increase their immunogenicity and decrease their tumorigenicity,the effects are associated with the expression of ICAM-1 and MHC molecules on tumor cells surface.     

促凋亡基因PDCD5在骨肉瘤U2-OS细胞表达及对其促凋亡作用的研究

目的:观察外源性PDCD5基因对骨肉瘤细胞系U2-OS的促凋亡作用。方法:扩增重组质粒PCI-neo-PDCD5,采用脂质体转染的方法,将PDCD5基因转染骨肉瘤细胞U2-OS,RT-PCR检测转染后表达情况;撤除血清培养16h后,四甲基偶氮唑盐MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况;An-nexinV-染色流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹法分析凋亡通路。结果:转染骨肉瘤细胞U2-OS后,RT-PCR检测到PDCD5的表达,MTT实验发现撤除血清后转染重组质粒组细胞的增殖被明显抑制。于转染空载体和对照组细胞相比,存活细胞明显减少,P<0.001。AnnexinV染色,流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与转染空质粒组(凋亡率为1.47%)相比,其凋亡率为10.28%。经PDCD5处理的细胞中,Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表达与对照组比较,差异均有统计学意义。结论:PDCD5基因可以在转染的骨肉瘤细胞系U2-OS细胞中表达,并在撤出血清因素的诱导作用下可显著抑制转染细胞的生长,并通过线粒体激活途径发挥促凋亡作用并诱导细胞发生凋亡。     

Bcl-2反义核酸增强三氧化二砷诱导NCI-H69肺癌细胞凋亡

目的 :探讨Bcl 2反义核酸对三氧化二砷 (As2 O3 )诱导NCI H6 9肺癌细胞株凋亡的影响。方法 :合成Bcl 2反义核酸 (ASON) ,导入NCI H6 9肺癌细胞。Western blot法检测Bcl 2蛋白的表达 ;FTIC TUNEL流式细胞仪检测导入ASON的NCI H6 9肺癌细胞凋亡的变化 ;Western blot法检测As2 O3 作用后多聚ADP核糖聚合酶 (PARP)裂解片段。结果 :1)导入Bcl 2反义核酸后NCI H6 9肺癌细胞 (ASON -NCI H6 9)的Bcl 2基因表达受抑制 ,Bcl 2蛋白的合成减少 ;2 )随As2 O3 浓度增加 ,肺癌细胞的凋亡指数逐渐上升 ,ASON NCI H6 9细胞凋亡指数明显高于NCI H6 9细胞 ;3)As2 O3 诱导后ASON NCI H6 9肺癌细胞PARP的89KD裂解片段检测呈强阳性 ,NCI H6 9肺癌细胞则呈弱阳性。结论 :三氧化二砷可诱导肺癌细胞株NCI H6 9凋亡 ;Bcl 2反义核酸通过阻断Bcl 2基因表达 ,增强了As2 O3 诱导NCI H6 9细胞凋亡     

小鼠TERT启动子的克隆及在肿瘤细胞中的转录活性研究

目的：克隆不同长度的小鼠端粒酶逆转录酶（mouse telomerase reverse transeriptase,mTERT）启动子,研究其在小鼠肝癌细胞Hepal-6、结肠癌细胞CT26、恶性黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞NIH3T3中的转录活性。方法：以Hepal-6细胞的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增不同长度的mTERT启动子片段,分别命名为mTERT1至7;然后分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3～Basic构建真核表达载体;采用脂质体Lipofectamine2000将重组质粒分别和pRL—CMV共转染Hepal-6、CT26、B16和NIH3T3细胞,采用双荧光素酶法检测不同长度的mTERT启动子片断在细胞中的转录活性。结果：双酶切和测序鉴定均显示不同长度的mTERT启动子克隆成功及其表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示mTERT1至5在3种肿瘤细胞中有较高的转录活性,而在NIH313细胞中的活性较低,mTERT6和mTERT7在所有细胞中均很低;同一片断在不同肿瘤细胞株中活性不同。结论：mTERT核心启动子区位于ATG上游333bp内,且具有肿瘤特异性。     

Changes in lactate dehydrogenase enzyme pattern in Chinese hamster cells infected and transformed with Simian virus 40.

The lactate dehydrogenase (LDH) isozyme patterns of consecutive passages of Chinese hamster embryo cultures were monitored. At early passages the population displayed two LDH bands, M4 and M3H; however, at higher passages the cultures exhibited M2H2, M2H, and M4. When primary cultures of Chinese hamster embryo cells were infected with simian virus 40 (SV40), no change in the LDH pattern was observed; however, the total activity of LDH increased. Twenty-three of 25 transformed colonies isolated from SV40-infected primary cells by their ability to grow in methyl cellulose produced only M4 or M4-M3H isozymes bands. Four of the SV40-transformed clones that produced only the M4 isozyme were tested for LDH activity and found to have activities 2.5 to 3 times greater than the control cells. Chinese hamster kidney epithelial cells transformed with SV40 virus had a decrease in the H subunit production, from 57 to 31%, compared with normal kidney epithelial cells. This decrease in H subunit production led to an increase in the cathode-migrating isozymes. Therefore, a shift to the cathode-migrating isozyme was observed in SV40-transformed cells. This change in LDH pattern might represent a reversion to the enzyme pattern present in fetal cells.     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

pEgr-MDA7重组质粒辐射诱导特性的检测

背景与目的：克隆人MDA7 cDNA基因,构建pEgr-MDA7重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中经辐射诱导后mRNA水平。材料与方法：从人外周血mRNA中克隆人MDA7 cDNA基因,连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr- MDA7重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用定量PCR方法检测不同剂量X射线照射后被转染细胞中MDA7的mRNA水平。结果：测序结果证实MDA7 cDNA基因序列正确,酶切鉴定证实pEgr-MDA7重组质粒构建正确。被pEgr- MDA7重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量X射线照射后,MDA7基因mRNA水平均高于未照射组。结论：X射线可诱导pEgr- MDA7重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。