弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。     

弓形虫pVAX1-SAG2真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答

目的　构建弓形虫主要速殖子表面抗原 2 (SAG2 )编码基因真核表达质粒pVAX1-SAG2 ,并接种小鼠 ,分析其所诱导的免疫应答。方法　以限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切从重组质粒 pGEM/SAG2中获得SAG2目的基因片段 ,约5 92个bp ,将其插入真核表达载体 pVAX1多克隆位点 ,构建重组质粒 pVAX1-SAG2 ,并转化大肠杆菌JM 10 9,阳性克隆以双酶切与PCR法鉴定。大量提取纯化重组质粒 pVAX1-SAG2 ,5 0 μg肌肉注射小鼠左后腿内侧肌肉 ,3周后加强免疫一次 ;RT-PCR检测SAG2在小鼠肌肉中的转录表达 ,流式细胞仪测定T细胞亚群 ,以速殖子虫体抗原作ELISA测定小鼠血清IgG抗体。结果　真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符合。RT -PCR从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带 ;重组质粒 pVAX1-SAG2免疫组CD+ 4 细胞数为 32 .35± 5 .38,显著高于空质粒pVAX1及生理盐水 (NS)二对照组 (P <0 .0 1) ,后二者CD+ 4 细胞数分别为 19.6 5± 4 .2 1与 17.84± 1.5 9;免疫组CD+ 8细胞数为 18.6 7± 2 .37,但与空质粒及NS对照组相比 ,差别不显著 (P >0 .0 5 )。ELISA测定结果显示 pVAX1/SAG2免疫组小鼠血清中出现抗弓形虫特异性IgG抗体。结论　构建成功SAG2真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2 ,其能在     

弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定

目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段，并进行序列分析。方法 设计合成引物，从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后，克隆到原核表达质检pGEX-47-2中，转化入大肠杆菌JMl09，用PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因，构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3)，酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3，并经酶切及序列分析所验证，为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。     

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的　扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法　设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论　GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。     

弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定

目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果　从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。为重组质粒的进一步表达和核酸疫苗的研究创造了条件     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1（SAG1）和微线体蛋白3（MIC3）的重组真核表达载体pcDNA3．1-SAG1-MIC3并鉴定，为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAGl和MIC3基因片段。分别克隆人pMD18T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定；采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3．1-SAG1-MIC3，PCR、酶切和测序鉴定；采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞，经RT—PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定，大小分别为933bp和789bp，与预期值一致；pcNDA3．1-SAG1-MIC3经酶切鉴定，目的片段约为1722bp．与SAG1MIC3长度相当；测定重组载体的核苷酸序列。与GenBank中的相应序列100％同源；PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1SAG1-MIC3．为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CTP基因真核表达载体的构建

目的构建恶性疟原虫CTP 基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank 已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3. 结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中. 结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功.     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAG2 基因位点分析

目的 目的 初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法 方法 运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基 因的两个片段分别进行基因提取、 扩增, 然后对PCR产物进行回收纯化、 酶切及测序, 并与弓形虫基因I型标准株进行对 比鉴定。结果 结果 从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因 （241、 221 bp）, 从其中扩增阳性的全 血样本中各选择4份分别进行酶切, 扩增出目的基因片段, 进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进 行对比, 酶切SAG2基因 （241 bp） 显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型, 酶切SAG2基因 （221 bp） 确定基因型均为Ⅰ型。结 结 论 论 初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。     

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAG2 基因位点分析

目的 目的 初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法 方法 运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基 因的两个片段分别进行基因提取、 扩增, 然后对PCR产物进行回收纯化、 酶切及测序, 并与弓形虫基因I型标准株进行对 比鉴定。结果 结果 从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因 （241、 221 bp）, 从其中扩增阳性的全 血样本中各选择4份分别进行酶切, 扩增出目的基因片段, 进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进 行对比, 酶切SAG2基因 （241 bp） 显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型, 酶切SAG2基因 （221 bp） 确定基因型均为Ⅰ型。结 结 论 论 初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。     

应用核酸原位分子杂交法检测弓形虫SAG1抗原基因在免疫小鼠体内的表达

PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列,构建pcDNA3－SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠,3周后处死动物,取注射部位肌肉作冰冻切片,用原位分子杂交方法检测弓形虫pcDNA3-SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG1编码区目的基因,片段大小为1020bp。测序、酶切分析表明构建的pcDNA3-SAG1重组表达质粒含有扩增的基因。利用原位分子杂交在免疫接种pcDNA3－SAG1的小鼠骨骼肌中检测到紫蓝色的阳性杂交信号,提示局部肌肉有目的基因mRNA转录的发生。     

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。     

云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的SAG2基因位点分析

目的初步了解云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型特征。方法使用基因提取试剂盒提取龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因,运用巢式PCR技术分别对弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)进行扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪下观察结果。用DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并进行酶切,酶切产物置于37℃恒温培养箱孵育16h,孵育后的酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像观察结果并与弓形虫基因Ⅰ型标准株进行对比鉴定。结果 112份HIV阳性者全血37份扩增出弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)。从37份弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)扩增阳性的全血标本中选择条带较亮的6份进行酶切,并与弓形虫基因I型标准株比对,初步确定2号标本为基因Ⅲ型,其他标本为基因Ⅰ型。从酶切的6份标本中选择2份进行测序,其中1份为酶切Ⅲ型(测序的2号标本)。经过基因序列对比分析,各弓形虫株之间SAG2基因的碱基对差异较小。其中基因Ⅰ型36份,Ⅲ型1份。结论初步确定云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型以Ⅰ型为主,Ⅲ型少见,未见Ⅱ型及其他基因型。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的原核细胞表达及其抗原性分析

目的构建弓形虫GJS株表面抗原1（SAG1）重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列（$76248）及其编码氯基酸序列的同源性分别为99％、97％;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。     

敏感性PCR检测猪肉弓形虫方法的建立与应用

目的建立一种敏感快速的猪肉弓形虫PCR检测方法,并用来检测市售猪肉弓形虫的感染情况。方法采用不同数量的弓形虫模拟感染猪肉样本,分别以529 bp重复序列、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作为目标检测基因,对其敏感性进行评价,在此基础上运用敏感的靶标检测100份市售猪肉样本中弓形虫的感染情况。结果 529 bp重复序列的敏感性最高,用此靶标检测合肥市售猪肉,弓形虫阳性率为17%。结论 529 bp重复序列基因是一个可用于肉制品中弓形虫PCR检测的理想靶标。