抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论：在大肠杆菌中成功地表达了抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）基因的融合蛋白     

亚性疟原虫HRPⅡ基因的克隆与表达

采用ＰＣＲ方法特划性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ基因,经基因序列测定后克隆于ＰＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１。在不同菌株浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＨＲＰⅡ融合蛋白的表达。采用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析对表达产物进行鉴定。结果显示ＨＲＰⅡ基因与ＰＷＲ４５０－１重组后大肠杆菌ＴＧ１中表达－６８ＫＤａ的融合蛋白,当工程菌ＯＤ５     

人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达

目的：用酵母细胞表达重组人成纤维细胞生长因子（ｈＦＧＦ１３）蛋白并检测其活性。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ从流产胎儿脑组织中钓取ｈＦＧＦ１３ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＹＥＸ４Ｔ－１载体质粒。在酏母细胞表达ＧＳＴ＿ｈＦＧＦ１３融合蛋白。以细胞增殖实验测定酵母表达蛋白粗提物的活性。结果：ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合刷拓酵发母细胞中得到表达;ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合蛋白细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖,而且此活性能够被ＦＧ     

恶性疟原虫HRPⅡ基因的克隆与表达

采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ基因,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＨＲＰⅡ融合蛋白的表达。采用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析对表达产物进行鉴定。结果显示ＨＲＰⅡ基因与ｐＷＲ４５０－１重组后在大肠杆菌ＴＧ１中表达一６８ＫＤａ的融合蛋白,当工程菌ＯＤ５９０为１．０～１．２时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,表达量较高。Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＨＲＰⅡ基因表达产物能被抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体所识别     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1在大肠杆菌中的分泌型表达

中毒休克综合征毒素１（Ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅｔｏｘｉｎ－１，ＴＳＳＴ－１）在中毒休克综合征（Ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＴＳＳ）的发病过程中起重要作用。本研究应用ＰＣＲ和ＤＮＡ重组技术，构建了ＴＳＳＴ－１分泌型表达载体ｐＲＴＳ２０并在大肠杆菌细胞周质表达出分子量为２２×１０３的重组ＴＳＳＴ－１，表达量约占周质总蛋白的６％～８％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交表明，表达产物具有特异的抗原活性。对ＴＳＳＴ－１生物学特性、结构功能关系有待进一步研究。本文对ＴＳＳＴ－１抗毒素的制备具有一定的参考意义。     

人TRAIL在毕氏酵母表达系统中的表达

目的 在甲醇营养型酵母（Ｐｉｃｈｉａ）中,表达人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）分子。方法 将可溶性ＴＲＡＩＬ基因片段插入酵母表达载体ｐＩＣ３．５,经氯化锂转化酵母ＧＳ１１５,甲醇诱导表达,５ｄ后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析,并用Ｌ９２９细胞测定其活性。结果 在酵母细胞中表达的ＴＲＡＩＬ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析占总蛋白的５０％以上。用抗人ＴＲＡＩＬ多抗检测表     

人细胞间粘附分子1基因功能区Ⅰ,Ⅱ的克隆及高效表达

用ＰＣＲ聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ－１）ｃＤＮＡ中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ１８５个氨基酸的ＤＮＡ序列，构建了重组质粒ｐＥＴ／ｒｓＩＣＡＭ－１。经转化宿主菌，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

人FascDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

为获得高质量及充足的Ｆａｓ蛋白，采用ＰＣＲ技术调整Ｆａｓ基因的开放阅读框架，使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致；缺失了ＦａｓｃＤＮＡ基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子，构建ＦａｓｃＤＮＡ和生物素化融合原核表达质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔ－Ｆａｓ。将重组质粒转入大肠杆菌ＨＢ１０１，经５００ｍｍｏｌＩＰＴＧ在３７℃条件下诱导４ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测融合蛋白在大肠杆菌得以高效表达，表达量为细菌总蛋白的１３．８％。用亲和层析树脂对生物素化融合蛋白进行亲和层析纯化，得到Ｆａｓ重组的蛋白，且表达的Ｆａｓ融合蛋白具有抗体结合活性。此蛋白的表达成功将解决Ｆａｓ膜蛋白不易提取的难题，为深入研究Ｆａｓ提供了良好材料来源     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

人内皮抑制素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂活性

利用酵母真核细胞表达系统表达出重组人内皮抑制素 (Endostatin) ,并对其促成纤维细胞有丝分裂活性进行研究。方法 :采用逆转录 PCR技术自人肝组织获得人内皮抑制素的cDNA ,将其克隆入真核表达载体pYEX4T 1,构建含人Endostatin的重组质粒 (pYEXEndo) ;经全自动序列分析仪测序确证后 ,将此重组质粒转化入酵母细胞 (DY15 0 )中进行诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot鉴定。以MTT掺入法初步检测了重组人内皮抑制素对NIH3T3细胞的促有丝分裂活性。结果 :经CuSO4诱导的含pYEXEndo的酵母细胞表达出重组人GST Endostatin的融合蛋白 ,此蛋白在凝胶上表现为一约 45kD的阳性区带 ,在Westernblot实验中可被GST特异性多克隆抗体识别。重组人GST Endostatin融合蛋白的粗提物在体外能刺激NIH3T3细胞增殖。结论 :人GST Endostatin的融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达 ,并具有刺激成纤维细胞生长的生物学活性。     

鼠成纤维细胞因子8的克隆和表达

目的 :克隆和表达鼠成纤维细胞因子 8(FGF 8) ,以便进一步研究FGF 8的功能。方法 :根据已发表的鼠成纤维细胞因子 8的cDNA序列 ,从鼠胚胎中提取总RNA ,采用RT PCR技术 ,用设计合成的引物钓取cDNA片段。将该cDNA片段定向插入酵母表达载体pYEX4T 1中 ,做DNA序列分析。用此重组质粒转化酿酒酵母 ,经Western印迹分析表达产物。用MTT和3H TdR掺入法检测重组蛋白活性。结果 :经序列分析证明 ,所钓取到的 6 0 0bp的cDNA片段确实是FGF 8的“b”选择性剪接型(FGF 8b)。Western印迹分析表明 ,该基因获得了较高效的表达 ,分子量约 5 5kD。实验组成纤维细胞株NIH3T3的MTT和3H TdR掺入量明显增多 ,拮抗组的掺入量有所下降。结论 :获得了有活性的重组鼠FGF 8蛋白 ,该蛋白能刺激NIH3T3生长 ,并且这种活性能被重组人FGFR 1的细胞外段所拮抗     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

人FGF12融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：在原核表达系统中获得高效表达的人成纤维生长因子12融合蛋白。方法：采用逆转录PCR方法获得hFGF12 cDNA，将其连接到pET 28a原核表达载体，转化入BL21(DE3)菌中表达，经金属螯合亲和层析法和肝素亲和层析法纯化，以刺激NIH 3T3成纤维细胞增殖实验；测定纯化的hFGFl2融合蛋白活性。结果：表达产物经SDS-PAGE电泳，在Mr31000附近新增一条明显区带，与预期的相对分子质量相符。重组融合蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖。结论：在大肠杆菌中表达了具有促有丝分裂活性的融合蛋白。     

人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

目的:在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白。检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析。方法:从人淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc,然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc,并将其插入pPIC9载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达。采用ELISA筛选高表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株,对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构,采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性,最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链。结果:成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株,摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2mg/L。SDS-PAGE和Western blot表明,该融合蛋白能自然形成二聚体结构;可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用,其中和5×104U/LTNF-α的EC50为170μg/L。FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11~13个糖残基。结论:在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白,为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

葡萄球菌肠毒素O表达及其生物学活性的初步分析

目的 克隆葡萄球菌肠毒素O(seo)基因,构建其两种原核表达载体,表达、纯化重组蛋白SEO,并对其生物活性进行初步研究.方法 设计引物PCR获得seo成熟肽基因,将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1、pET28a,转化E coli BL21、E coli BL21(DE3),重组蛋白分别经GST亲和层析、镍螫合层析纯化,利用Western blot验证重组SEO的免疫原性,MTT法测定重组SEO对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用,Caspase 3酶活及DNA电泳分析重组SEO诱导细胞凋亡的能力.结果 克降的seo基因序列与报道的序列完全相同.纯化获得重组蛋白GST-SEO和P28-SEO的表达量分别占菌体蛋白的25%和22%.免疫印迹表明两种蛋白均具有良好的免疫原性.生物活性检测表明,低剂量的肠毒素对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用,较高剂昔则会导致细胞凋亡.结论 两种重组的SEO仍具有超抗原的活性,对小鼠脾淋巴细胞具有诱导凋亡的能力.     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

Production of polyclonal antibodies to feline tumor necrosis factor.

Two 13-amino-acid peptides were synthesized based on the putative feline tumor necrosis factor (FeTNF) sequence. The synthesized peptides were conjugated to keyhole limpet hemocyanin, emulsified in complete Freund's adjuvant, and injected into rabbits. The gene for FeTNF was cloned into the FLAG (International Biotechnologies Inc. [IBI], Kodak, New Haven, Conn.) fusion protein expression vector. The expressed fusion protein was purified by using the M-1 anti-FLAG octapeptide monoclonal antibody (IBI, Kodak). The fusion protein was emulsified in complete Freund's adjuvant and injected into chickens. The immune sera generated to the synthetic peptides and the fusion protein recognized the recombinant FeTNF fusion protein on Western or dot blot assay. The preimmune and immune sera were incubated with naturally occurring FeTNF (supernatants from lipopolysaccharide-stimulated cultured feline peritoneal exudate or peripheral mononuclear cells). The antibody raised to the recombinant FeTNF fusion protein and N-terminal synthetic peptide neutralized bioactivity of native FeTNF and recombinant human TNF. Preimmune sera did not have any neutralizing activity. The polyclonal antibodies were not specific for FeTNF, since both porcine and human recombinant TNF were neutralized by the fusion protein antibodies. The synthetic peptide antibodies recognized recombinant feline and equine TNF on a Western blot.