半胱天冬氨酸蛋白酶-12小干扰RNA对小鼠肝细胞凋亡的阻抑

目的观察小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）构建的表达载体pRNAT-casp12对caspase-12基因的抑制及其对内质网应激介导的小鼠肝细胞凋亡的影响。方法以小鼠肝细胞株Hepa1-6为靶细胞，利用脂质体与重组质粒pRNAT-casp-2共转染，分别在转染24、48和72h后收集细胞，采用实时荧光定量PCR分析和Western印迹检测caspase-12的表达；利用毒胡萝b素（TG）诱导细胞，建立内质网应激介导的细胞凋亡模型，通过DNA梯带凝胶电泳检测，选出适合的诱导时间；TG诱导已转染了pRNAT—casp12的干扰组细胞后，以空质粒转染组为对照，利用Western印迹检测caspase-12蛋白表达水平的变化，通过DNA梯带凝胶电泳、流式细胞仪、Hoechst33258染色等方法检测细胞凋亡，观察caspase-12siRNA对细胞凋亡的影响。结果pRNAT—casp12转染细胞24、48和72h后，caspase-12mRNA的水平分别下降了45．6％、72．5％和59．5％；caspase-12蛋白表达下降了17．1％、37．3％和60．1％；2μmol／L TG处理细胞30h后，成功诱导细胞凋亡；与对照组相比，干扰组细胞经TG诱导后，caspase-12蛋白表达水平下降了54．6％，流式细胞仪检测发现早期调亡率下调了51．4％（P〈0．01）。结论小鼠caspase-12siRNA对Hepa1—6细胞caspase-12基因的表达具有显著的抑制作用，能够明显阻抑内质网应激介导的凋亡，有望发展成为新一代抗凋亡药物。     

内质网应激相关蛋白在大鼠急性脊髓损伤中的表达及其意义

目的探讨大鼠急性脊髓损伤处内质网应激相关蛋白(CHOP)的表达及细胞凋亡变化与内质网应激对于急性脊髓损伤的相关性。方法选取56只健康SD大鼠随机分为实验组与对照组,每组28只,然后按损伤时间点将每组分为3、24 h、3、7 d四时点组(每组7只),每组均在其脊髓损伤后计算时间。实验组采用Allen法制作大鼠急性脊髓损伤动物模型,而对照组只切开椎板不损伤脊髓。运用改良Tarlov评分法评价其神经功能;进行心脏灌注和免疫组织学染色,然后观察其组织学形态和测定累积光密度检测CHOP表达情况,并应用缺口原位末端标记法(TUNEL)测定平均光密度检测神经细胞凋亡情况。结果对照组各大鼠均未见明显运动功能损害,而实验组出现不同程度的下肢功能障碍,实验组大鼠后肢运动功能障碍在3 d时最明显,另外各时间点对照组大鼠改良Tarlov评分差别均具有统计学意义;组织学检查发现实验组3 h时大鼠脊髓组织主要以坏死细胞为主,1 d是凋亡细胞较多,3 d时凋亡细胞最多;各时间点实验组CHOP表达与对照组均具有统计学差异;实验组脊髓损伤后3 h与1 d CHOP表达差异无统计学意义,1 d与3 d、3 d与7 d CHOP表达均具有统计学差异,其中3 d时CHOP表达最高;实验组3 h时细胞凋亡情况与对照组无统计学差异,而1、3、7 d时两组细胞凋亡均具有统计学差别;实验组3 h和1 d、1 d和3 d,3 d和7 d之间细胞凋亡均具有统计学差别,其中3 d时细胞凋亡最明显;CHOP表达与细胞凋亡相关分析得到Pearson相关系数为0.729,差异具有统计学意义。结论急性脊髓损伤能够诱导内质网相关蛋白CHOP表达,内质网应激诱导的神经细胞凋亡可能与CHOP表达升高有关。     

蛋白酶体抑制剂单用或联合顺铂对人胃癌细胞的抑制效应

背景：蛋白酶体抑制剂通过阻断泛素．蛋白酶体通路中的蛋白降解，致使错误折叠蛋白或受破坏蛋白堆积．启动热休克反应并进一步导致细胞死亡，对多种恶性肿瘤细胞具有抑制作用。目的：探讨蛋白酶体抑制剂Z-Leu—Leu—Phe-CHO（ZLLFC）单用或联合顺铂对人胃癌细胞株SGC-7901体外增殖和凋亡的影响及其对肿瘤多药耐药相关切除修复交叉互补基因1（ERCC1）mRNA表达的影响。方法：将ZLLFC和顺铂单独或联合作用于SGC-7901细胞。以甲基噻唑基四唑（MITT）法检测细胞存活率，透射电子显微镜观察凋亡细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率．逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测ERCC1 mRNA表达。结果：ZLLFC或顺铂单独作用后，SGC-7901细胞存活率较对照组显著降低（P〈0．01），呈现轻度凋亡形态；ZLLFC联合顺铂组细胞存活率较单用顺铂组显著降低（P〈O．01），细胞凋亡率显著升高（P〈O．01），呈现明显凋亡形态。联合组ERCC1 mRNA表达显著低于单用顺铂组（P〈0．01）。结论：蛋白酶体抑制剂ZLLFC能轻度抑制人胃癌细胞株SGC．7901生长，诱导细胞凋亡，与顺铂联用具有协同抑制效应。ZLLFC可能通过下调ERCC1转录水平逆转顺铂耐药，从而增强顺铂的抗肿瘤作用。     

放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法采用6MV-X射线照射细胞,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA-LADDER的形成,Western印迹方法检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达。结果照射后48h,2、4、6Gy剂量组出现明显DNA降解（梯形结构）,但对照组及8、10Gy剂量组无“梯形结构出现”。Western印迹方法分析发现照射后48h,2、4、6Gy剂量组HepG2细胞Caspase-3蛋白表达明显增高,与假照射对照组（0Gy）比较,差异具有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论X射线能在体外诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能是通过激活Caspase-3蛋白表达实现的。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人巨噬细胞THP-1凋亡

泛素-蛋白酶体途径是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一，广泛参与细胞周期调控、DNA修复、细胞信号转导、细胞凋亡等多种生理过程。为了研究调控泛素一蛋白酶体途径表达对巨噬细胞THP-1凋亡和细胞内载脂蛋白B的蓄积的影响，本实验采用蛋白酶体抑制剂MG132(5／μmol／L)处理THP-1细胞，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞内载脂蛋白B含量，用半定量逆转录一聚合酶链反应检测细胞内UPP途径相关基因的表达。结果发现：MG132可以诱导THP-1细胞凋亡；实验组细胞内载脂蛋白B蓄积增加；实验组细胞内泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素-蛋白连接酶mRNA表达均降低，而26S蛋白酶体mRNA无显著改变。结果提示，蛋白酶体抑制荆MG132能够诱导THP-1细胞凋亡，其机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径中泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素一蛋白连接酶活性，使细胞内载脂蛋白B经泛素-蛋白酶体途径降解减少，在细胞内蓄积而使细胞凋亡率增加。     

藤黄酸调控白血病K562细胞GFI-1表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的: 探讨藤黄酸对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法：体外培养K562细胞，采用CCK-8法检测不同浓度藤黄酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0μmol/L)处理24、48、72h后K562细胞增殖率；用流式细胞术检测K562细胞的凋亡和周期；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR)）和Western blot法检测独立生长因子1(GFI-1) 的mRNA及蛋白表达水平。结果： 藤黄酸可以抑制K562细胞的增殖，并呈剂量、时间依赖性；0.4μmol/L藤黄酸处理24h后的K562细胞凋亡率增加；藤黄酸对GFI-1的mRNA表达无显著影响，藤黄酸可以下调GFI-1蛋白的表达；藤黄酸及蛋白酶体抑制剂（MG132）共处理后的K562细胞GFI-1蛋白水平较藤黄酸组升高；藤黄酸及氯喹（CQ）共处理后的K562细胞GFI-1蛋白水平与藤黄酸组无统计学差异（P>0.05）。结论： 藤黄酸可以有效抑制K562细胞的增殖并诱导细胞凋亡；藤黄酸可以诱导K562细胞G0/G1期及S期阻滞；藤黄酸通过蛋白酶体途径促进GFI-1蛋白降解。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

Ad-Gax转染对缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的影响

目的观察Gax基因转染对缺氧性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）凋亡及其相关基因表达的影响。方法腺病毒介导Gax转染体外原代培养的PASMCs。透射电镜观察细胞凋亡形态;原位细胞凋亡检测法观察Ad-Gax转染前后在常氧和缺氧处理2h,6h、12h、24h、48h大鼠PASMCs凋亡情况;免疫细胞化学法测PASMCsBcl-2、Bax蛋白表达。结果透射电镜观察到Ad-Gax转染后PASMCs产生凋亡现象。未转染缺氧刺激前后,均无或可见极少量的阳性细胞;Ad-Gax转染后,如无缺氧刺激,也无或仅可见少量的阳性细胞,予缺氧刺激后,阳性细胞显著增多,尤其在转染后24～48h更明显。转染组常氧、缺氧2h,6h、12h、24h、48h细胞凋亡百分率均显著高于未转染组（P〈0．01）。Ad-Gax转染前,与常氧时比较,缺氧刺激PASMCs后,Bax蛋白表达略为升高但无统计学意义;而Bcl-2蛋白表达显著升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。Ad-Gax转染PASMCs后,缺氧刺激使Bcl-2蛋白表达显著降低（P〈0．01）,Bax蛋白表达显著增高（P〈0．01）。转染组细胞凋亡率与Bcl-2／Bax比值呈负相关（r=-0．53,P〈0．01）。结论Ad-Gax转染可诱导缺氧性PASMCs凋亡,其机制可能是通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达,尤其是通过降低Bcl-2／Bax比值实现的。     

内质网应激及其相关性凋亡在多巴胺能神经元选择性变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激反应（endoplasmic retieulum stress response，ERS）及相关凋亡途径在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法6羟基多巴胺（6-OHDA）、N-甲基-4苯基吡啶离子（MPP^＋）、鱼藤酮作用于神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞，MTT及流式细胞仪方法检测各种药物的神经毒性作用及细胞凋亡率，应用RT-PCR和Western印迹技术观察以上药物处理后ERS通路中XBP1、Grp78、CHOP表达水平的变化及相关凋亡因子caspase-12的活化和利血平耗竭胞内多巴胺水平后的影响。结果3种神经诱变剂处理PC12细胞后，细胞活力呈浓度依赖性下降，其中6-OHDA 100μmol／L、MPP^＋ 75μmol／L、鱼藤酮20nmol／L作用24h使细胞活力分别下降52％、44％、40％。流式细胞仪显示的细胞凋亡率在8h、16h、24h内逐渐增高（P〈0．01）。RT—PCR及免疫组化检测显示处理后XBP1、Grp78表达和CHOP的基因及蛋白表达水平明显增加，分别在8h、16～24h达到高峰（P〈0．01）。caspase-12 mRNA水平也在诱导后16h显著升高（P〈0．01），利血平预处理使其基因表达减弱（P〈0．05）。结论内质网应激和相关凋亡途径是多巴胺能神经元选择性变性死亡的内在环节之一。     

脂质运载蛋白-2在川崎病相关心肌损伤中的作用及机制研究

目的 探讨川崎病（KD）相关心肌损伤的可能机制。 方法 将45只（1月龄）SD大鼠随机分为对照组、干酪乳杆菌细胞壁成分(LCWE)模型组和4-苯基丁酸（4-PBA）治疗组。建立大鼠川崎病模型4周后，用酶联免疫吸附剂测定法ELISA检测KD大鼠血浆和心肌组织匀浆中脂质运载蛋白（Lcn）2的含量；超声心动图检测大鼠心脏功能；各组大鼠心肌组织制作石蜡切片并进行细胞凋亡TUNEL染色；蛋白质印迹法（Western blot）检测大鼠心肌内质网应激的标志物表达变化。离体实验采用原代培养新生大鼠心肌细胞，Lcn 2处理48 h后检测细胞活力、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）3活性以及内质网应激程度。 结果 与对照组比较，KD大鼠血浆和心肌组织匀浆中Lcn 2的含量显著升高（P<0.05）。用Lcn 2（10 ng/ml）处理原代培养的心肌细胞48 h后可导致心肌细胞活力显著降低（P<0.05），同时标志物活化转录因子（ATF）6、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、磷酸化的蛋白激酶R样内质网激酶（p-PERK）、磷酸化的真核起始因子（p-elF）2α均出现升高，导致凋亡信号Caspase 12和活化的Caspase（cleave-Caspase）3水平显著增高（P<0.05）。KD大鼠心肌出现促凋亡性内质网应激，ATF6、CHOP、p-PERK、p-elF2α均显著升高，导致凋亡信号Caspase 12和cleave-Caspase 3水平显著增高（P<0.05）。同时伴有左室舒张末期内径（LVIDd）显著增加（P<0.05），左室射血分数（LVEF）显著降低（P<0.05）。使用4-PBA后能够有效抑制KD状态下的心肌内质网应激程度，降低ATF6、CHOP、p-PERK、p-elF2α水平，降低Caspase 12和cleave-Caspase 3水平（P<0.05），同时有效提升LVEF（P<0.05），改善KD大鼠心脏泵血功能，减少LVIDd（P<0.05），并最终改善KD大鼠舒张功能。 结论 KD诱发心脏收缩舒张功能障碍同时伴有Lcn 2 显著升高。Lcn 2对心肌细胞的直接作用是促凋亡性内质网应激。抑制KD状态下的心肌内质网应激可抑制心肌凋亡改善心脏功能。