转染骨形态发生蛋白-2基因的人脐带间充质干细胞成骨研究

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染人脐带间充质干细胞(hUCMSC)对其成骨分化和体内异位成骨的影响.方法 实验分为3组,空白组:10％胎牛血清+ DMEM培养基,对照组:10％胎牛血清+DMEM培养基+空慢病毒载体转染,实验组:10％胎牛血清+DMEM培养基+BMP-2+增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染,检测3组不同培养基培养后人脐带间充质细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性变化,蛋白印迹法检测骨桥蛋白(OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、BMP-2的蛋白表达变化.yon kossa染色观察hUCMSC钙结节形成.大鼠肌袋内植入BMP-2转染hUCMSC/COL1,通过CT三维重建及苏木素-伊红(HE)染色观察其体内成骨能力.结果 hUCMSC BMP-2转染良好,转染率可达到(90.95±4.35)％,实验组细胞在第5天,ALP活性就由(26.492 ±7.105) U/g·蛋白增加至(38.625±11.592) U/g·蛋白,在第14天,实验组的ALP的活性可以高达(49.732±13.068) U/g·蛋白,对比空白组和对照组都有明显增加(P＜0.05).对比空白组和对照组,实验组COL1、BMP-2和OPN蛋白呈现高表达(P＜0.05).转染BMP-2基因后,hUCMSC培养28 d可形成大量的钙结节.BMP-2转染hUCMSC/COL1在大鼠肌袋内可异位成骨.结论 转染BMP2基因可促进hUCMSC细胞成骨能力.     

低浓度纳米银促进脐带间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究纳米银对人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的毒性作用及成骨分化影响。方法首先,从人脐带中分离出hUCMSC,通过免疫荧光双染对hUCMSC进行细胞鉴定。将纳米银及硝酸银作用于hUCMSC24 h,用CCK-8细胞活力测试检测它们的细胞毒性,得出最大安全质量浓度。以此质量浓度的纳米银及硝酸银作用于hUCMSC,以碱性磷酸酶(ALP)活力、茜素红染色及定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测纳米银及硝酸银对hUCMSC成骨分化的影响。用罗丹明-鬼笔环肽染色检测纳米银对hUCMSC细胞骨架的作用,用蛋白免疫印迹法测试纳米银对hUCMSC RhoA蛋白水平的影响。结果纳米银及硝酸银的细胞毒性呈剂量依赖性,在纳米银4μg/mL及硝酸银2μg/mL时,无细胞毒性作用发生。与空白组及硝酸银组相比,在4μg/mL纳米银作用下,hUCMSC的ALP活性更高,形成钙结节的量更多,且成骨分化相关基因(Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白-2、Ⅰ型胶原蛋白α1链)的表达更高。罗丹明-鬼笔环肽染色显示,纳米银可诱发hUCMSC的肌动蛋白聚合,增加细胞骨架张力。蛋白免疫印迹法测试显示,纳米银提高了活化RhoA蛋白水平,而硝酸银无此作用。结论纳米银可在合适的质量浓度通过活化RhoA蛋白、诱导肌动蛋白聚合及增加细胞骨架张力提高hUCMSC的成骨分化能力,且此作用与银离子无关。     

骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究

目的:探索骨髓间充质干细胞膜片的体外构建简便方法,并评估其成骨分化潜能。方法:将兔骨髓间充质干细胞高密度接种,在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。通过组织学、碱性磷酸酶活性定量检测、透射电镜和扫描电镜等方法,检测细胞膜片的特性。结果:高密度连续培养及成骨诱导后形成骨髓间充质干细胞膜片。HE染色证实膜片是一种由多层细胞和细胞外基质组成的聚集体;茜素红染色呈阳性;碱性磷酸酶定量分析含量较高;扫描电镜及透射电镜检查均见基质中大量的矿化结节聚集。结论:通过体外简单的连续培养和成骨诱导后,可形成具有良好成骨能力的骨髓间充质干细胞膜片。     

低能量激光治疗在骨科领域的研究进展

低能量激光治疗(LLLT)可促进多种细胞的增殖和分化。例如,它可促进骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化,促进骨形成;促进脂肪间充质干细胞(ADSC)增殖和分化,促进生长因子的分泌;促进成骨细胞及人BMSC增殖、黏附和成骨分化;促进成纤维细胞增殖等。LLLT在骨科中常用于促进骨愈合及骨修复、改善骨质疏松、抑制炎症和缓解疼痛、促进创面愈合、治疗腕管综合征及修复脊髓损伤和周围神经损伤等。该文就LLLT在骨科领域的研究进展作一综述。     

骨髓间充质干细胞与骨组织共培养模型的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)与骨组织共培养模型,模拟体内成骨环境,以全面研究骨髓间充质干细胞及细胞支架复合物的生物性状.方法:通过插入式培养皿和培养板来构建细胞一组织共培养的模型,将新鲜兔骨碎粒及骨块与骨髓间充质干细胞共培养,观察共培养条件下细胞的形态学变化、ALP活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.结果:构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型.共培养的间充质干细胞同期ALP活性高于普通培养对照组,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性,对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性.结论:体外构建的共培养模型部分模拟了体内成骨环境;经过共培养的细胞呈现成骨细胞的表型.     

人脂肪来源干细胞培养鉴定及其向内皮细胞分化能力的研究

2001年,Zuk等[1]证实从脂肪组织提取物(PLA)中存在一类间充质性质的成体干细胞--脂肪间充质干细胞或简称为脂肪干细胞(ADSCs),通过以外科切除或吸脂手术方式获得的人或鼠脂肪组织为研究对象,消化离心后简单处理脂肪组织,获得一个显微镜下呈成纤维细胞形态的细胞群.这类细胞易于培养,在体外可向骨、软骨、肌腱和脂肪细胞等分化,其符合定义干细胞的两个必要条件,一是具备自我更新能力,二是在特定条件下具备多向分化的能力[2].我们从来源于人皮下的脂肪组织中分离出该细胞,进行体外培养,观察其形态特点和生物学特性,利用诱导剂将其向内皮细胞方向分化,用于植入体内后改善组织缺血状况.     

长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的观察体外长期培养对人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）成骨分化潜能的影响,探讨其作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法流式细胞技术观察长期体外培养的UCB-MSCs细胞表面抗原表达的变化规律,并通过Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测观察长期体外培养对UCB-MSCs成骨特性的影响。结果第10代之前的UCB-MSCs能够高表达间充质干细胞表面标志物,7代之前的细胞体外增殖能力不随传代次数而发生明显变化。Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测显示8代之前的UCB-MSCs仍能保持较强的成骨分化能力。结论7代之前的UCB-MSCs能保持稳定的体外成骨分化特性,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞。     

人原发性骨关节炎与正常人关节软骨间充质祖细胞多向分化能力的对比研究

[目的]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,探讨关节软骨间充质祖细胞在原发性骨关节炎发病中的重要作用。[方法]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨(微团培养)诱导分化后的细胞形态变化,TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色,GAG含量及Ⅱ型胶原mRNA表达;成骨(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,钙结节染色,ALP活性及BGPmRNA表达;成脂(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,油红染色,油红染色阳性细胞比率及TG含量。[结果]原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨诱导分化后细胞TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色均呈阳性,原发性骨关节炎者GAG含量减少及Ⅱ型胶原mRNA表达减弱(P<0.05);成骨诱导分化后细胞钙结节染色均呈阳性,原发性骨关节炎者ALP含量减少及BGPmRNA表达减弱(P<0.05);成脂诱导分化后细胞油红染色均呈阳性,原发性骨关节炎者TG含量增加(P<0.05)。[结论]关节软骨间充质祖细胞经成软骨、成骨及成脂诱导后均能分化为具有相应功能细胞特性的分化细胞。原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞成软骨和成骨分化能力降低,而成脂分化能力增加,提示原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞分化功能出现异常,骨关节炎关节软骨细胞对软骨损伤修复能力降低。     

Wnt3 a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化 过程中端粒酶活性的影响

目的探索Wnt3a信号分子对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45,筛选并鉴定细胞。采用成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a(5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化,以碱性磷酸酶活性检测评价其成骨分化能力。通过TRAP-ELISA端粒酶活性检测法检测在不同浓度的wnt3a干预下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中端粒酶活性的表达。结果骨髓间充质干细胞传至第3代后可获得均一性较高的细胞,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD45低表达。成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a诱导大鼠BMSCs 7 d后,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测结果:与普通成骨诱导培养基相比,含有5 ng/mL及25 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基可显著增加其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05),而含有100 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基则明显抑制其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05)。与普通成骨诱导培养基相比,联合诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,端粒酶活性的改变无明显的统计学差异。结论小剂量(5 ng/mL、25 ng/mL)的wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞成骨分化,而大剂量(100 ng/mL)的wnt3a分子则抑制其成骨分化。骨髓间充质干细胞具有较弱的端粒酶活性,成骨分化过程中其活性逐渐减弱,直至消失;wnt3a信号分子刺激并不能有效激活其端粒酶活性。     

外泌体非编码RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

骨髓间充质干细胞是一种具有自我更新和多项分化潜能的干细胞,针对其成骨分化作用的研究对骨缺损、骨再生等骨组织工程有重大意义。外泌体内含miRNA、lncRNA、circRNA等非编码RNA,可通过多种途径调控骨髓间充质干细胞的成骨分化,其研究成果可以为促进成骨分化、治疗骨质疏松症等疾病提供新的靶点与方法。本文就外泌体中miRNA、lncRNA以及circRNA对BMSCs成骨分化作用机制的研究进展做一综述。     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

小鼠胎肝间充质干细胞的体外成骨诱导及复合陶瓷化骨的实验研究

目的探讨小鼠胚胎肝脏间充质干细胞的体外分离培养方法，并观察其成骨分化潜能及与陶瓷化骨支架材料的复合能力。方法将小鼠胎肝组织制成单细胞悬液行原代和传代培养，流式细胞仪检测其表面标志。用化学成骨诱导体系对纯化的胎肝间充质干细胞行成骨诱导，并进行成骨功能检测。将其与经过Ⅰ型胶原表面改性的陶瓷化骨复合培养，观察细胞在其上的黏附生长情况。结果原代培养的胎肝间充质干细胞，具有集落形成能力，为梭形或多角形。易于传代，传代细胞与原代细胞大小、形态相似。流式细胞仪检测表明，传代后的细胞CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性，表达间充质干细胞的特征标志。成骨诱导7d后碱性磷酸酶染色可见有较多阳性细胞，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性；14d后，细胞碱性磷酸酶活性定量检测明显增高；28d后，矿化结节染色呈阳性。将细胞与经胶原表面改性后的煅烧陶瓷化骨复合培养。扫描电镜见载体上有大量细胞黏附于材料表面。结论小鼠胎肝间充质干细胞易于获取及传代；体外成骨诱导后可向成骨细胞方向分化；能在陶瓷化骨支架材料上黏附生长。     

THSD4基因在小鼠间充质干细胞及MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用

目的 探讨THSD4基因对小鼠间充质干细胞和MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 提取绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞进行基因测序分析,与骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞进行比较,分析基因表达差异。通过提取不同分化阶段的小鼠骨髓间充质干细胞（M-BMSC）及MC3T3-E1细胞的mRNA来检测THSD4 基因以及成骨分化的标志性基因（ALP、Runx2、Osx）的表达水平。通过构建慢病毒表达载体来实现对M-BMSC及MC3T3-E1细胞中THSD4的敲减及过表达,并观察其对M-BMSC及MC3T3-E1细胞成骨分化能力的影响。结果 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且通过KEGG以及GO富集分析发现THSD4基因可能与PI3K-AKT信号通路及Wnt信号通路相关。随着成骨诱导分化时间的延长,THSD4 mRNA和成骨分化标志性基因（ALP、Runx2、Osx）mRNA在MC3T3-E1以及M-BMSC中表达量均逐渐增加。过表达THSD4可以增强MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力,而敲减THSD4则减弱了MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力。结论 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且THSD4基因可以增强MC3T3-E1细胞以及M-BMSC的成骨分化能力。     

Hippo信号通路成骨、成肌分化功能研究进展

Hippo信号通路在器官发育和组织修复等多种生物学行为中起着重要作用。Hippo通路下游效应因子YAP和TAZ与TEAD转录因子共同构成Hippo信号转导网络的连接点来调节基因表达。越来越多的证据表明，Hippo通路既可通过调节骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）来影响成骨分化功能，又可通过调节骨骼肌卫星细胞和成肌细胞来影响成肌分化功能。本文对Hippo信号通路的结构、以及成骨、成肌的研究进展作一综述，以期更深入理解Hippo通路成骨、成肌功能，并为肌少-骨质疏松症的临床治疗提供新的研究方向。     

GFP转基因鼠肌卫星细胞系的构建及基因介导成骨分化的实验研究

目的 评价肌卫星细胞(Muscle satellite cells,MSCs)体内外成骨分化的能力,探讨肌卫星细胞作为骨组织工程新的种子细胞的可能性.方法 取新生绿色荧光蛋白转基因小鼠颌面部肌肉,采用酶消化法分离出MSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物的活性检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化及体内成骨的检测.结果 转染后细胞碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色呈阳性;骨钙素(OC)免疫细胞化学染色呈阳性且OC活性增强(p＜0.05);21天后见钙结节形成;转染后的细胞与材料复合物植入裸鼠后肢肌肉内,4周后见骨组织形成.结论 体外培养的肌卫星细胞体内外可以成骨分化,可以成为骨组织工程的新的种子细胞.     

脐带间充质干细胞分化为内皮细胞促进血管新生

目的 探讨脐带间充质干细胞能否在体内外分化为内皮细胞,参与血管新生.方法 体外实验采用内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对脐带间充质于细胞进行诱导,观察其形态变化.体内实验将脐带间充质干细胞移植到小鼠后肢缺血模型中,采用免疫组织化学鉴定细胞在体内的迁移和分化,激光多普勒血流成像仪鉴定缺血局部血流恢复情况.结果 在体外脐带间充质干细胞能够形成血管网样结构.在体内脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,表达CD31抗体,参与实验组的动物血管重建.与小鼠的血管网络发生整合,实验组的动物后肢血流灌注明显好于对照组.结论 脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,参与血管新生,为治疗性血管新生提供新的细胞选择.     

TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞体外的影响

[目的]探讨组织型谷胺酰氨转胺酶2 (TG2)对大鼠鼻粘膜来源的间充质干细胞体外增殖以及定向成骨分化的影响。[方法]体外分离培养大鼠鼻粘膜间充质干细胞,采用MTT和免疫荧光法检测不同浓度的TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞增殖能力的影响。通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色、蛋白质印迹法和免疫荧光观察TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞体外成骨分化能力的影响。[结果]谷胺酰氨转胺酶2能促进鼻粘膜间充质干细胞增殖(P0.05),并能提高ALP活性(P0.05),同时增强矿化钙结节形成能力,并对成骨相关标记蛋白COL I和OCN的表达具有上调作用。[结论]谷胺酰氨转胺酶2可提高大鼠鼻粘膜来源的间充质干细胞的增殖能力以及其向成骨细胞分化的潜能。     

体外培养的人脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的:了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力.方法:体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数,行成骨和成脂诱导,流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子.结果:人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106,而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G 2/M所占比例分别为79.1%、19.7%和1.3%.分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化.结论:脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点,体外能够向成骨和成脂方向分化.     

间充质干细胞成骨性能的影响因素

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)因高度的自我增殖与多向分化能力在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景。目前,MSC成骨分化的研究很多,但体外、内的成骨效率仍然较低。因此,提高MSC的成骨性能成为关注热点。MSC成骨性能受多方面因素的影响,我们从细胞来源、分离纯化、诱导策略及血管化等4个方面对影响MSC成骨性能的因素进行综述。     

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。