纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

锌指转录因子snai1高表达质粒构建和稳定株的筛选

背景：研究表明Snai1和E-钙黏素在肿瘤组织中有负向表达关系，且与Snai1与CDH1启动子区box盒结合，抑制CDH1基因转录。 目的：构建针对snai1的高表达载体，建立稳定转染的细胞株。 方法：根据GenBank中snai1的基因序列人工合成snai1全序列，将合成好的序列装入Pmd-18T载体并转化感受态细胞DH5α，进行阳性克隆筛选。测序验证重组克隆中基因序列正确后，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切Pmd-18T/snai1质粒，将所得的snai1全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒，构建pcDNA(+)/snai1真核表达质粒，同时构建阴性对照质粒，并分别对结肠腺癌细胞HT-29进行转染，最后利用G418进行稳定表达株的筛选，并采用RT-PCR和Western blot鉴定宿主细胞内snai1基因的表达情况。 结果与结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA(+)/snai1，顺利转染结肠癌细胞HT-29后于600 mg/L G418浓度时筛选 21 d得到snai1基因稳定表达株，构建的snai1基因正义表达质粒pCDNA3.1(+)/snai1转染宿主细胞后可促进snai1基因的表达。 关键词：锌指转录因子snai1；表达质粒；感受态细胞；结肠癌；转染     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

转染碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达及调控系统的建立

背景：作者前期研究已经成功将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor, bFGF)基因转入鼠眼外肌的肌卫星细胞中，证明其能够在眼外肌的成肌细胞中表达并促进细胞增殖，促进其分化能力。 目的：进一步探讨转染后碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达的调控方法。 方法：将目的基因碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA连接，通过经菌落PCR和酶切鉴定的阳性克隆测序和EcoRⅠ and Hind Ⅲ双酶切处理和Xho Ⅰ单酶切处理验证。筛选并确定C2C12成肌细胞的抗生素的敏感性。通过脂质体转染技术，建立C2C12稳定表达pcDNA6/TR细胞系，经Western blot (蛋白印迹法)鉴定。将pcDNA4/TO/myc-孙HisTMA-bFGF转染到pcDNA6/TR-C2C12细胞系，免疫荧光法及Western blot法检测碱性成纤维细胞生长因子在四环素诱导的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的C2C12细胞内的表达及其分泌情况，并设对照。 结果与结论：①经测序对照，双酶及单酶切处理均证实碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA成功连接。②blasticidin对C2C12细胞的最小致死浓度为10 mg/L，zeocin对C2C12细胞的最小致死质量浓度为750 mg/L。③建立的pcDNA6/TR- C2C12细胞系正确。④经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA- bFGF的成肌细胞基因表达阳性，未经处理的则为阴性；经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc- HisTMA-bFGF的成肌细胞产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白，24 h达高峰，未处理的则不能产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白。结果提示应用四环素抑制调节系统，可以调节碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中的表达。     

重组质粒pEGFP-mDlX5的构建及其在SVZa神经干细胞中的表达研究

目的构建真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5,并了解它在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞(NSCs)中的mRNA及融合蛋白表达情况。方法运用DNA重组技术自原核表达载体上将小鼠来源的mDlx5基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)载体上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用电穿孔的方法转染SVZa NSCs,荧光显微镜下动态观察荧光变化情况;培养24h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)了解其mRNA表达情况,用Western blot 检测其蛋白表达情况。结果重组质粒通过双酶切产生了0．78 kb目的插入片段及4．68 kb载体片段;测序后证实0．78 kb片段碱基序列与mDlx5基因完全同源;重组质粒转染SVZa NSCs 8 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后逐渐增多,24-48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过 RT-PCR检测到mRNA表达,Western blot检测到58 kD目的蛋白表达。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5通过鉴定,结构正确:转染到SVZa NSCs后能在其中表达、发挥功能,为后续研究奠定了基础。     

Der p 2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。 目的：构建Der p 2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2005-05/12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。 材料：C57BL/6小鼠；plambd-Der p 2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。 方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDer p 2携带的Der p 2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCI-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCI-neo的树突状细胞为对照。 主要观察指标：①pCI-neoDer p 2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测Der p 2mRNA和蛋白表达。 结果：测序证实构建的重组质粒中携带了Der p 2的全长cDNA序列，且与Gene Bank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达Der p 2 mRNA和Der p 2蛋白。 结论：成功构建重组Der p 2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

Rapsyn重组质粒转染小鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可能性,并观察Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达。方法采用全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL/6小鼠的BMSCs,在体外进行扩增、传代。取第3代细胞,采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至BMSCs中,并置荧光显微镜下观察转染结果;采用Western blot法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达。结果 BMSCs经转染后24h可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染pEGFP-N1/Rapsyn质粒的BMSCs可稳定表达Rapsyn蛋白。结论利用脂质体介导法可将Rapsyn基因转染至BMSCs中,并能稳定表达Rapsyn蛋白。     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性☆

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。 目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。 结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。