RNA原位杂交技术难点及针对措施

利用互补RNA为探针进行原位杂交是分析组织或细胞内RNA分布行之有效的方法,通过对RNA分布的研究可以了解特定基因的表达情况。用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的mRNA是较为常见的RNA原位杂交。该探针方法简便、探针较短,组织穿透性好,有较高的灵敏度。但是过程较长,操作繁琐,     

小鼠Y染色体RNA探针的标记和应用

目的标记小鼠Y染色体RNA探针，检验该探针在检测外周血涂片和脑组织切片Y染色体阳性细胞的效率。方法以小鼠Y染色体重复序列pY353/B cDNA为模板标记RNA探针。以雌性小鼠为对照，用原位杂交法检测小鼠外周血涂片Y染色体阳性细胞；用荧光原位杂交法检测雄性小鼠脑组织切片Y染色体阳性细胞。结果Y染色体原位杂交法在外周血涂片Y染色体阳性的检测灵敏度和特异度均为100％，在脑切片检测Y染色体阳性细胞的灵敏度和特异度分别为85．67％和100％。结论小鼠Y染色体RNA探针的原位杂交和荧光原位杂交法检测Y染色体阳性细胞有较高的灵敏度和特异度。     

寡核苷酸探针RNA原位杂交法检测肺孢子虫的研究

目的探讨RNA原位杂交法在肺孢子虫病理检测中的应用。方法采用小亚单位RNA位点来源的寡核苷酸探针、地高辛加尾标记、Wistar雌性大鼠皮下注射地塞米松建立肺孢子虫肺炎动物模型,取肺组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交,并将结果与瑞氏-吉姆萨染色法进行比较。结果 RNA原位杂交法于感染后第3周检到虫体,呈游离分布;7～8周时检测到大量包囊;9～10周时滋养体大量出现;组织内肺孢子虫的检出率（32/32）高于瑞氏-吉姆萨染色法（25/32）。结论 RNA原位杂交法是一种敏感特异的肺孢子虫病理检测方法。     

原位杂交组织化学技术

<正> 近几年随着基因工程的进展,新兴的分子遗传学中有些研究手段已被引入神经科学领域中。其中之一便是原位杂交组织化学技术(in situ hybridization histochemical technique)。众所周知,以往的免疫组织化学技术是在组织上检测某种特定的蛋白质、神经肽或糖类等的重要手段;与其相反,原位分子杂交技术则是检测组织内的蛋白质、神经肽的前体信使RNA(mRNA)的方法。原位分子杂交技术有几种方法。如:从已经确定的核苷酸序列制作30-50 mer的合成DNA,再用某些方法将之标记以其做为探针的方法;用互补DNA     

一种进行基因表达研究的有效技术--小鼠全胚胎RNA原位杂交

目的　建立小鼠整体胚胎水平研究基因表达的方法。　方法　采用地高辛配基标记的造血相关基因 Runx1和神经发生相关基因 Runx3RNA探针 ,对 10 .5～ 14天小鼠全胚胎进行 RNA原位杂交 ,通过检测胚胎组织中 m RNA的存在状况来观察基因的表达。结果　在小鼠胚胎观察到 Runx1和 Runx3基因在不同组织中的清晰的杂交信号 ;不同探针和不同大小的胚胎需要不同的最适蛋白酶 K处理条件。　结论　小鼠全胚胎 RNA原位杂交技术是一种有效的研究基因表达的方法 ,可以从整体水平反映基因表达的全貌 ,在功能基因组学时代将具有很大的应用潜力 ,为基因表达研究提供了一种可与 L ac Z染色和免疫组织化学媲美的选择。蛋白酶 K处理条件是否适当是小鼠全胚胎 RNA原位杂交成功的关键因素。     

聚合酶链反应制备生物素标记原位杂交用探针

聚合酶链反应制备生物素标记原位杂交用探针张雷刘鸿瑞王志永原位杂交能良好地定位检测内、外源性核酸物质，并在研究疾病的发生、发展机制中具有重要的作用。但核酸探针的来源困难防碍了这一技术在病理学中的广泛应用。我们用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法制备ＥＢ病毒原位...     

甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义

目的 探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法 和意义.方法 取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经Hind Ⅲ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验.结果 TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性.核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果 一致.结论 成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA 的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法 ,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况.     

地高辛标记的小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ RNA 探针的制备和应用

为了制备小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶I(β-1,4-galactosyltransferase 1,β-1,4-GalT-1)地高辛标记的RNA探针以探讨β-1,4-GalT-I mRNA在坐骨神经组织的表达定位,本研究用提取的小鼠脑总RNA,采用RT-PCR方法,得到β-1,4-GalT-I的DNA片断,将其克隆到pGEM-T载体;采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针;运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度;最后应用该探针,通过原位杂交的方法,分析β-1,4-GalT-I mRNA在小鼠坐骨神经的表达.结果:构建了β-1,4-GalT-I/pGEM-T质粒,获得了高效价的地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针,应用该探针发现β-1,4-GalT-J在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达.以上结果表明,制备的地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA原位杂交探针可特异地检测β-1,4-GalT-1 mRNA在组织中的表达.本研究为进一步分析β-1,4-GalT-I在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础.     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

地高辛标记的小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶RNA探针的制备和应用

为了制备小鼠 β-1,4-半乳糖基转移酶 ( β-1,4-galactosyltransferase ,β-1,4-Gal T- )地高辛标记的 RNA探针以探讨β-1,4-Gal T- m RNA在坐骨神经组织的表达定位 ,本研究用提取的小鼠脑总 RNA,采用 RT-PCR方法 ,得到β-1,4-Gal T- 的 DNA片断 ,将其克隆到 p GEM-T载体 ;采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ;运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度 ;最后应用该探针 ,通过原位杂交的方法 ,分析 β-1,4-Gal T- m RNA在小鼠坐骨神经的表达。结果 :构建了β-1,4-Gal T- /p GEM-T质粒 ,获得了高效价的地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ,应用该探针发现 β-1,4-Gal T- 在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达。以上结果表明 ,制备的地高辛标记的正、反义 β-1,4-Gal T- RNA原位杂交探针可特异地检测β-1,4-Gal T- m RNA在组织中的表达。本研究为进一步分析β-1,4-Gal T- 在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础。     

固定条件对cRNA探针原位杂交检测的影响

原位杂交（in situ hybridization，ISH）的敏感性和杂交效率取决于如下几个方面：①探针的类型和杂交条件；②检测方法的敏感性；③组织的保存和固定。前两点所涉及的内容已有许多的文献报道。mRNA ISH的成功与否，组织的保存和固定相当关键，尤其要重视固定的时间和固定液的pH值。理想的固定应该可以防止组织细胞内mRNA丢失，探针能顺利到达靶RNA，并与之结合。ISH一般均用多聚甲醛固定组织。以使蛋白质上氨基快速发生交联，从而达到防止靶mRAN的丢失。[第一段]     

正、反义β-1,4半乳糖基转移酶Ⅱ和Ⅴ地高辛标记RNA探针的制备和应用

目的　为了探讨 β1 ,4半乳糖基转移酶 Ⅱ和Ⅴ (β1 ,4 galactosyltransferaseI,β 1 ,4 GalT ⅡandⅤ )表达定位 ,本实验通过分子生物学手段 ,制备正、反义 β 1 ,4 GalT Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针。 方法　设计引物 ,提取小鼠脑总RNA ,通过RT PCR方法 ,得到 β 1 ,4 GalT Ⅱ和Ⅴ基因序列 ,将其克隆到pGEM T载体。根据其多克隆酶切位点和Sp6及T7位置 ,分别酶切后作为转录模板 ,通过Sp6及T7RNA聚合酶 ,得到正、反义 β 1 ,4 GalT Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后 ,最后通过原位杂交分析标记探针的特异性和杂交效果。结果　本实验得到了高效价的正、反义 β 1 ,4 GalT Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针 ,并表现出很好的杂交效果。结论　正、反义β 1 ,4 GalT Ⅱ和ⅤRNA原位杂交探针的制备 ,为进一步研究 β 1 ,4 GalT Ⅱ和Ⅴ在组织中的表达 ,尤其在神经组织的定位奠定基础     

组织细胞的原位杂交技术

组织细胞的原位杂交技术是指利用碱基序列已经明了的、带有标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸进行杂交,从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对性定量分析的一种研究方法。其基本原理是:两个核酸分子的碱基序列如果互补,就可形成稳定的杂交分子。这一方法目前已广泛应用于组织细胞中mRNA以及病毒DNA和RNA的检测,它在病毒学、神经生物学、组织胚胎学、内分泌学以及病理学中均有着良好的应用前景。     

家蝇抗菌肽diptericin基因的组织表达研究

目的运用原位杂交方法检测家蝇抗菌肽基因dipericin组织表达模式。方法基于前期实时荧光定量PCR的结果 ,选取病原诱导12 h后的家蝇三龄幼虫,提取其RNA,克隆出dipericin保守序列,应用地高辛标记的diptericin基因反义RNA探针,对经多重耐药的大肠杆菌和耐甲氧西林葡萄球菌混合液刺激前后的家蝇幼虫组织切片进行组织原位杂交。结果 diptericin基因在诱导和未诱导家蝇幼虫的体壁和肌肉均未表达,在诱导后的脂肪体及中肠有高表达,在未诱导的家蝇幼虫部分组织内也有检测到阳性信号,如气管有很弱的表达,而马氏管则诱导与未诱导均有表达。结论家蝇抗菌肽基因diptericin在家蝇抵御外界微生物感染免疫防御中,有着极其重要的作用。     

地高辛标记的大鼠NGF RNA探针的制备和应用

制备用地高辛标记的神经生长因子(NGF)的RNA探针并用其研究NGF在海马组织中的表达。设计NGF引物,构建NGF/pGEMT重组质粒,分别用ApaⅠ和SacⅠ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig)正、反义RNA探针。运用点膜杂交的方法检测探针的敏感度;运用该探针的原位杂交法分析NGF在海马中的表达。本研究成功地构建了NGF/pGEMT质粒,获得了正、反义digNGFRNA探针,并应用该探针在海马中观察到NGFmRNA的表达。本研究的结果为深入探讨NGF在海马发育和损伤过程中的表达奠定了基础。     

荧光原位杂交在儿科遗传性疾病检测中的应用

荧光原位杂交(FISH)是近十几年来迅速发展形成的一项分子细胞遗传学新技术,是近代医学研究的又一重要进展.七十年代末,FISH用荧光素取代放射性同位素标记,克服了放射性杂交的一些弊端,使原位杂交技术大大地前进了一步.八十年代中,用生物素标记的核苷酸制备探针,成功地在组织切片上检测病毒DNA,为非放射性物质标记探针应用于临床奠定了基础.以后FISH又融合了多种分子生物学方法,目前已衍生为一技术系列,具有重要的理论意义和实用价值.该项技术准确、特异、敏感、安全、稳定、快     

大鼠脑组织原位杂交染色的几点体会

近年来，原位杂交技术的发展和方法的不断改进，已广泛地应用于组织内的靶RNA定量定位分析。但由于组织的来源不同，进行原位杂交染色组织的各期处理也不尽相同，尤其是脑组织中其含大量磷脂成分，质地柔软，原位杂交染色一直难以取得令人满意的结果。本实验室采用大鼠脑缺血模型进行caspas-3原位杂交染色，结果较为理想。     

地高辛精标记RNA探针原位杂交的简便方法

用地高辛精标记ＴＨ基因合成ＲＮＡ探针，在冰冻组织切片上进行原位杂交，通过碱性磷酸酶催化的呈色反应，检测在基因治疗帕金森病大鼠动物模型研究中酪氨酸羟化酶基因在脑内的表达。实验结果表明，简化原位杂交方法可适应于任何实验室。     

地高辛标记的大鼠p75 RNA探针的制备和应用

目的制备用地高辛标记的神经生长因子低亲和力受体(p75)的RNA探针.研究p75在海马组织中的表达.方法设计p75引物,构建p75/pGEM-T重组质粒,分别用ApaⅠ和Sac Ⅰ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig-)正反义RNA探针.运用点膜杂交的方法检验探针的敏感度,运用该探针,通过原位杂交分析p75在海马中的表达.结果构建了p75/pGEM-T质粒,获得高效价的正、反义dig-p75 RNA探针,应用该探针发现p75 mRNA在海马中的表达.结论成功制备了地高辛标记的p75RNA探针,为进一步研究p75在海马中发育和损伤过程中的表达打下基础.     

一种快速敏感检测特异性mRNA的原位杂交技术的研究

:本文介绍一种快速敏感的原位杂交方法。用光敏生物素标记管蛋白cDNA探针,经DNase I酶切成组织渗透性强适合原位杂交的短片段,作快速的原位杂交,再用胶体金标链亲和素系统检测杂交结果。整个过程操作方便,迅速,能保存较多的杂交信号,杂交结果清晰。