SOX9基因真核表达载体转染诱导BMSCs分化为类髓核细胞

目的椎间盘退行性变的生物学治疗方法是骨科学研究热点,寻找一种有效诱导BMSCs向椎间盘细胞分化的方法成为应用细胞移植治疗椎间盘退变的必要前提。探讨重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9 Flag体外转染诱导兔BMSCs向类髓核细胞分化的影响。方法构建真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9 Flag。取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并鉴定;流式细胞仪检测细胞表面标记。将第3代BMSCs随机分为转染组、阴性对照组和空白对照组。转染组转染pcDNA3.1IE-SOX9Flag重组质粒,阴性对照组转染质粒pcDNA3.1,空白对照组不转染任何质粒。将构建好的重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag转染第3代BMSCs,72h后加入浓度为500mg/L的G418筛选7d后,改为浓度200mg/L的G418维持筛选压力并培养转染细胞。取各组BMSCs采用RT-PCR检测SOX9和Ⅱ型胶原基因(Col2al)的mRNA表达,Western blot检测SOX9蛋白的表达,免疫组织化学染色观察Ⅱ型胶原的表达。结果 BMSCs成骨诱导7d后ALP染色呈阳性;CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。成功构建了真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9Flag。将重组质粒转染兔BMSCs,72h后转染效率为34.32%±1.75%;转染2周后BMSCs形态改变,呈多角形或椭圆形,细胞体积增大,增殖速度减缓,与椎间盘髓核细胞生长特点十分接近。RT-PCR鉴定发现转染组细胞SOX9 mRNA和Col2al mRNA表达阳性,对照组均为阴性。Westernblot检测发现转染组SOX9基因蛋白表达阳性,对照组未见表达。转染组BMSCs的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。结论 SOX9基因真核表达载体成功转染兔BMSCs,被转染的干细胞向类髓核细胞分化,为进一步研究应用BMSCs移植治疗椎间盘退行性变奠定了理论基础。     

T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3对干扰素-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性细胞因子的调节作用及机制

目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对IFN-γ活化的小鼠Kupffer细胞的调节作用并探讨其相关机制。方法将真核表达质粒pc DNA3.1-Tim3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Real-time PCR和Western blot检测Tim3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA检测质粒pc DNA3.1-Tim3、Tim3阻断型抗体对IFN-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)产生的影响,Western blot检测JAK2/STATl蛋白表达。结果 Real-time PCR检测结果显示,IFN-γ能够显著提高小鼠肝脏Kupffer细胞中Tim3 m RNA的表达水平(P0.05);pc DNA3.1-Tim3组的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌较对照组显著下降(P0.01);ELISA结果显示,Tim3阻断型抗体组与对照组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌增加(P0.01);Western blot检测显示,与对照组相比,Tim3阻断型抗体预处理的小鼠Kupffer细胞JAK2及STAT1蛋白的表达上调(P0.05)。结论Tim3通过调控Jak2/Stat1蛋白表达参与了Kupffer细胞活化的调节。     

髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA表达情况。结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30~100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因m RNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs(P0.05)。结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源。     

四环素联合桂枝加葛根汤对髓核细胞增殖和相关因子表达的影响

目的:探讨四环素(TET)联合桂枝加葛根汤(CK)对髓核细胞增殖和蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen,Col2a)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)表达的影响。方法:体外分离培养8周龄健康雄性SD大鼠髓核细胞并进行鉴定。然后用药物处理分离成功的髓核细胞:TET组分别应用不同浓度(5,10,15,20,25μg/ml)的TET处理,CK组分别应用低、中、高剂量TET处理,TET+CK组应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,对照组不添加药物。采用CCK8方法检测不同药物处理组细胞增殖活力;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测TET+CK组髓核细胞的aggrecan、Col2a、i NOS和MMP-13的mRNA表达量,免疫印迹(Western blot)检测Aggrecan、Col2a、i NOS和MMP-13的蛋白表达量。利用pc DNA3.1-CMV(+)构建重组质粒pc DNA3.1-i NOS,转染组用pc DNA3.1-i NOS转染髓核细胞,应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,空载体组用空载体(pc DNA3.1)转染细胞,应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,对照组不添加药物且不转染,应用q RT-PCR检测各组i NOS和MMP-13的mRNA表达量,Western blot检测各组i NOS和MMP-13的蛋白表达量。结果:分离培养的髓核细胞Col2a和Aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例分别为96%和98%。不同浓度TET或CK处理髓核细胞后细胞活力与对照组比较无显著性差异(P0.05)。20μg/ml TET和中剂量CK联合作用后髓核细胞的活力、Aggrecan和Col2a的mRNA和蛋白表达量均较对照组显著性升高(P0.05),i NOS、MMP-13的mRNA和蛋白表达量较对照组显著性下降(P0.05)。转染pc DNA3.1-i NOS重组质粒后髓核细胞i NOS和MMP-13的m NRA和蛋白表达与对照组和空载体组均显著性升高(P0.05)。结论:TET联合CK可促进髓核细胞增殖,增加髓核细胞Aggrecan和Col2a mRNA和蛋白的表达,同时可以通过抑制i NOS减少MMP-13 mRNA和蛋白的表达量,为药物预防和治疗椎间盘退变提供了理论依据。     

CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响

目的探讨CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养的方法体外分离纯化获得兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞表面MSCs相关抗原CD44、CD34、CD29、CD105的表达。使用α-1,3-岩藻糖转移酶Ⅵ(α-1,3-fucosyltransferaseⅥ,FTⅥ)对兔BMSCs进行体外岩藻糖基化处理作为实验组,以未经岩藻糖基化处理的BMSCs作为对照组,采用流式细胞仪检测唾液酸化Lewis X(sialyl-Lewis X,sLe~X)阳性率及E-选择素结合率。使用Hank平衡盐溶液重悬的岩藻糖基化BMSCs作为实验组(A组),未经岩藻糖基化修饰的BMSCs作为研究对照组(B组),添加EDTA冲洗的岩藻糖基化兔BMSCs作为阴性对照组(C组),利用平行板流室黏附试验检测兔BMSCs流体黏附力。结果兔BMSCs形态以长梭形为主,生长旺盛;第3代BMSCs CD44、CD29、CD105呈阳性表达,而CD34呈阴性表达。实验组sLe~X阳性率为32.52%±1.76%,显著高于对照组的1.48%±0.51%,差异有统计学意义(t=29.277,P=0.000);实验组E-选择素结合率为41.05%±1.84%,显著高于对照组的4.33%±0.92%,差异有统计学意义(t=35.674,P=0.000)。随着流体剪切力的增加,A组人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)表面黏附的BMSCs数量先升高后降低,而B、C组HUVEC表面几乎无BMSCs黏附。各剪切力作用下,A组HUVEC表面黏附的BMSCs细胞数均显著多于B、C组,差异有统计学意义(P0.05),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD44分子岩藻糖基化修饰能够增强兔BMSCs的流体黏附力。     

CDMP-1促进成人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1(CDMP-1)诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的可行性及最佳诱导浓度.方法 分离培养BMSCs,免疫荧光法检测BMSCs表面CD34,CD45,CD105表达.采用含0、10、50、100ng/ml CDMP-1的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21 d,倒置显微镜观察细胞形态变化;RT-PCR检测不同浓度CDMP-1组细胞Ⅱ型胶原和Aggrccan表达:免疫组化检测Ⅱ型胶原表达;番红O和阿利新蓝染色检测蛋白多糖表达.结果 成人BMSCs呈梭形漩涡状生长,CD44、CD105表达阳性,CD34呈阴性表达.CDMP-1诱导7 d后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化.不同浓度CDMP-1诱导21 d,Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义(P<0.05);Aggrecan的表达CM组和10 ng组之间差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间差异均具有统计学意义(P<0.05).免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性,阿利新蓝和番红O染色均为阳性.结论 含100 ng/mJ CDMP-1软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化.     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

乏氧环境下HIF-1α对肝癌细胞逆向分化影响的实验研究

目的探讨体外乏氧环境下低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对诱导肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并维持恶性生物学行为的影响。方法采用免疫磁珠分选出HepG2细胞中的CD133阴性细胞,分为2个大组:转染组转染siRNA-HIF-1α以沉默HIF-1α基因的表达,空白对照组不转染任何siRNA片段。2类细胞分别进行常氧及乏氧条件培养,本实验共分4组。采用MTT、克隆形成实验及Transwell小室实验检测细胞的增殖和侵袭能力,采用Western blot法及RT-PCR法检测细胞中HIF-1α、CD133、CD90及CD44的mRNA及其蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示:4组细胞的增殖率随乏氧培养时间延长而增高;24 h及以后,与空白对照组相比,经siRNA-HIF-1α转染后,转染常氧组和乏氧组的细胞增殖率降低(P0.05)。平板克隆实验结果显示:转染常氧组与转染乏氧组、空白对照常氧组与空白对照乏氧组比较其细胞形成克隆数的差异均有统计学意义(P0.05)。Transwell小室实验结果显示:乏氧培养后,转染组与空白对照组相比,迁移至下室的细胞数目减少(P0.05)。Western blot及RT-PCR结果显示:空白对照乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及其mRNA的表达水平均高于其余3组(P0.05);经siRNA-HIF-1α转染后,转染乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及mRNA的表达水平均较转染常氧组和空白对照常氧组降低(P0.05)。结论在乏氧环境下,低氧诱导因子HIF-1α可促进肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并增强其恶性生物学行为。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化成平滑肌细胞

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并体外定向诱导分化成平滑肌细胞,为BMSCs移植治疗勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法分离培养大鼠BMSCs,取第3~4代细胞,流式细胞术检测BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106、造血干细胞表面分子CD34和CD45、血管内皮细胞特异性表面分子CD31表达情况,采用平滑肌细胞诱导培养基诱导分化,通过免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)进行鉴定细胞分化。结果培养细胞阳性表达BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106,同时造血干细胞表面分子CD34和CD45及血管内皮细胞表面分子CD31阴性表达,且经过平滑肌细胞诱导培养基诱导分化后α-SMA和Desmin免疫荧光检测均阳性反应。结论成功从大鼠骨髓中分离培养BMSCs,为BMSCs和基因修饰BMSCs移植治疗ED提供种子细胞。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

干细胞向生殖细胞分化的研究进展

干细胞(SCs)具有在体外分化为生殖细胞的潜能,为研究生殖细胞(GCs)早期发育提供了良好的模型,并将为干细胞移植修复生殖功能提供细胞资源。本文综述了胚胎干细胞/诱导多能干细胞(ESCs/iPSCs)、新生儿附属物来源干细胞(NDSCs)以及成体干细胞(ASCs)向生殖细胞分化所取得的研究进展,同时总结了各类干细胞向生殖细胞分化时所遇到的障碍及所面临的挑战,为干细胞在生殖医学领域的应用提供理论依据。     

大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞混合培养的研究

外培目的观察小鼠雪旺细胞体养时对大鼠神经干细胞存活及分化的影响。方法获取Wistar鼠坐骨神经并采用组织块法分离和纯化雪旺细胞；体外分离新生乳鼠脑神经干细胞，将雪旺细胞和神经干细胞分别培养扩增后进行共培养。共分5组进行：实验组1（NSC悬浮＋SC悬浮＋DMEM／F12）；实验组2（NSC悬浮＋SC贴壁＋DMEM／F12）；试验对照组1（SC培养基＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组2（EGF／bFGF＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组3（NSC＋DMEM／F12）。倒置相差显微镜对各组培养细胞每天观察形态和计数，免疫组织化学检测混合培养细胞特异性标记物的表达：SC采用P0和S100，NS采用nestin标记，神经干细胞分化神经元分别采用GFAP、GalC、Tubulin-β染色。结果共培养组NF染色阳性神经元样细胞的百分率明显高干其他各组；实验组1克隆球直径明显高于其他各组，其平均直径为8μm；实验组神经元样细胞突起的长度比对照组的长，3周长度差为26．5-67．3μm。结论大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞共培养使两者不仅能够共生，而且雪旺细胞能显著促进体神经干细胞分化为神经元样细胞；神经干细胞分化神经元突起增长并且有序排列成轴索样结构。     

Induction of regulatory T cells from mature T cells by allogeneic thymic epithelial cells in vitro

The ability of thymic epithelial cells (TEC) to re‐educate mature T cells to be regulatory T cells has not been addressed. In the present study, this issue was directly investigated by co‐culturing of mature T cells and allo‐TECs. B6 macrophage cell line 1C21‐cultured BALB/c splenocytes responded to B6 antigens in vitro. However, BALB/c splenocytes precultured with B6‐derived TECs 1‐4C18 or 1C6 did not proliferate to B6 antigens, but responded to rat antigens. Exogenous interleukin‐2 (IL‐2) failed to revise the unresponsiveness of these T cells. Allo‐TEC‐cultured T cells predominantly expressed Th2 cytokines (IL‐4 and IL‐10). B6 TEC‐cultured BALB/c splenocytes markedly inhibited the immune responses of naïve BALB/c splenocytes to B6 antigens, but not to rat or the third‐party mouse antigens. BALB/c nude mice that received naïve syngeneic splenocytes rejected B6 or rat skin grafts by 17 days postskin grafting; however, co‐injection of B6 TEC‐cultured BALB/c splenocytes significantly delayed B6 skin graft rejection (P < 0.01), with the unchanged rejection of rat skin grafts. These studies demonstrate that allo‐TECs are able to ‘educate’ mature T cells to be regulatory cells, and suggest that regulatory cells derived from mature T cells by TECs may play an important role in T cell tolerance to allo‐ and auto‐antigens.     

骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞作为组织工程瓣种子细胞的对比

目的 诱导分化骨髓间充质干细胞(BMSC)及内皮祖细胞(EPC),进行BMSC及EPC作为组织工程瓣膜(TEHV)种子细胞的对比.方法 分离扩增BMSC及EPC,分别定向诱导分化为内皮细胞,比较两种细胞在形态学、增殖能力、黏附力以及细胞冻存和复苏率方面的特点与区别.结果 光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,BMSC的形态为梭形或多角型,EPC的形态为圆形及不规则形状,第2代诱导的BMSCs、EPCs的倍增时间分别为34 h和35 h,诱导后的BMSC冻存和复苏率以及黏附力与EPC之间差异无统计学意义;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上.免疫组织化学结果显示两种细胞种植后的瓣膜上均有间质细胞生长.结论 BMSC和EPC诱导后可分化为内皮细胞,两者之间差异无统计学意义,都是合适的TEHV种子细胞.     

人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间质干细胞（MSC）在体外培养条件下能否定向诱导分化为表皮细胞。方法抽取无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本，采用Percoll细胞分离液（1．073g／ml）分离MSC，在体外传代培养至第3代，分为对照组和实验组。两组分别用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导7d。在倒置相差显微镜下每天观察两组细胞的形态；采用免疫组织化学法检测P63和广谱细胞角蛋白（PCK）的表达情况。结果实验组细胞由长梭形逐渐转变为扁圆形或形态不规则，部分细胞P63和PCK呈阳性表达；对照组细胞持续呈长梭形，P63和PCK未见表达。结论人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞。     

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法。方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pc DNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的Ha Cat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10%FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量。结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义。结论:转染EGF的Ha Cat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨诱导脂肪干细胞(ADSCs)向血管内皮细胞(ECs)分化的可能性,为ADSCs应用于创伤修复的理论提供实验依据.方法 切取大鼠脂肪组织,用酶消化法分离、培养ADSCs,流式细胞仪检测第3代ADSCs的CD49d和CD106的表达以鉴定ADSCs.实验组用含30%大鼠血管匀浆液的条件培养液诱导大鼠ADSCs,空白对照组用含10%胎牛血清DMEM培养液培养大鼠ADSCs,各组诱导3 d后经免疫组化和流式细胞仪检测ADSCs中CD34和血管性假血友病因子(vWF)相关抗原的表达变化.结果 流式细胞仪检测ADSCs的CD49d和CD106阳性率分别为(98.32±0.37)%和(1.67±0.61)%;血管条件培养液诱导组细胞CD34和vWF阳性率分别为(77.14±0.76)%和(75.46±0.37)%,较空白对照组(1.38±0.31)%和(1.70±0.23)%均升高,差异有统计学意义(P<0.01).结论 ADSCs可以被诱导向ECs表型分化,提示ADSCs具有参与创伤后血管形成的潜能,可以应用于创伤修复的治疗.     

间充质干细胞联合输注促进造血干细胞移植后的造血重建

目的探讨间充质干细胞(MSCs)与造血干细胞(HSCs)共同移植对造血重建的影响。方法将扩增的Balb/c小鼠骨髓MSCs与骨髓共同经尾静脉输入经致死剂量照射的同系小鼠体内(联合输注组),并设单输骨髓细胞的HSCs组、单输间充质干细胞的MSCs组以及输培养基的对照组,每隔5d计数白细胞,计算动物死亡率。将乙酰乙酸碳氧荧光素标记的人间充质干细胞输入SCID小鼠尾静脉,24h后取肺、心、肝、脾、肾和小肠组织做冰冻切片;取骨髓、肝脏及脾脏,制成单细胞悬液,涂片,在荧光显微镜下观察计数;用逆转录聚合酶链反应测定鼠骨髓中人特异性β2-微球蛋白。结果细胞输注后,联合移植组的白细胞恢复快,12d左右恢复正常,死亡率(3/11)低于HSCs组(5/10)、MSCs组(4/4)、输培养基的对照组(11/11)。人MSCs输入SCID小鼠后24h,其在体内的分布依次为肺、肾、脾、肝,小肠及心脏组织中几乎无阳性细胞,骨髓中有极少MSCs。结论MSCs与造血干细胞共输能促进造血恢复。     

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

目的 建立有效的体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)分化为肝细胞样细胞的培养体系.方法 将H9 hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上,序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化:100μg/L细胞因子活化素A( activin A)诱导3d,20 μg/L骨形成蛋白4(BMP-4)和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导4d,10μg/L肝细胞生长因子(HGF)诱导5d,最后以含10 μg/L制瘤素M(OSM)及1×10-7 mol/L地塞米松(Dex)的培养液继续诱导4d.于细胞诱导分化第16天,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平;过碘酸-雪夫反应(PAS)试验和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能.结果 activin A、BMP-4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构,呈多角形或卵圆形;RT-PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子-4α(HNF4-α)、1-抗胰蛋白酶(AAT)等肝脏特异性基因;免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白;PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能.结论 体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞.