母胎细胞转运与乙型肝炎病毒宫内感染关系的研究

目的探讨母胎细胞转运与乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的关系。方法用STRPCR、As-PCR及hemi-nPCR技术扩增HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血中胎儿DNA及母亲DNA，通过检测TH01、GSTM1、ACE等位基因确定母．胎细胞转运与胎．母细胞转运。采用巢式病例对照研究方法分析母-胎细胞转运与HBV宫内感染的关系。结果以GSTM1、ACE基因多态性判定母亲源性或胎儿源性等位基因，42对信息病例中有26例新生儿发生了母．胎细胞转运(61．90％，26／42)；40对信息病例中有32例发生了胎-母细胞转运(80．00％，32／40)；10对母胎发生了双向转运。统计分析显示母-胎细胞转运与HBV宫内感染有关联，胎．母细胞转运与HBV宫内感染无关联，母-胎细胞转运与胎-母细胞转运无关。母-胎细胞转运、孕妇PBMC HBV DNA阳性是HBV宫内感染的危险因素，二者未显示交互作用；母-胎细胞转运、孕妇PBMC HBV DNA阳性与新生儿PBMC HBV感染有关，两因素间亦未显示交互作用。结论母胎之间存在细胞转运，母-胎细胞转运是HBV宫内感染的危险因素，这可能是对HBV宫内感染途径的补充。     

乙型肝炎病毒宫内感染的细胞分子机制

目的 :探讨HBV宫内传播的细胞分子机制及其对新生儿的影响。方法 :将 12 3例HBsAg阳性孕妇新生儿按发生和未发生HBV宫内感染进行分组。用巢式PCR和选择性PCR法分别对 12 3例HBsAg阳性孕妇及其新生儿血清、外周血单个核细胞 (PBMC)中HBVDNA进行检测。结果HBsAg阳性孕妇血清及外周血PBMC中HBVDNA阳性率分别为4 3 0 9%和 30 0 8% ,新生儿血清、PBMC中HBVDNA阳性率分别为 19 5 1%和 2 6 0 2 %。而且HBsAg阳性孕妇PBMCHBVDNA与血清HBVDNA无关联 (χ2 =1 4 7,P =0 2 3) ;新生儿PBMCHBVDNA与血清HBVDNA无关联 (χ2 =0 83,P =0 36 ) ;HBsAg阳性孕妇血清HBVDNA与新生儿血清HBVDNA有关联 (χ2 =4 5 8,P =0 0 3) ,而与新生儿PBMCHBVDNA无关联 (χ2 =0 2 5 ,P =0 6 2 ) ;HBsAg阳性孕妇PBMCHBVDNA与新生儿PBMCHBVDNA显著相关 (χ2 =2 1 6 1,P =0 0 1) ,也与新生儿HBV宫内感染显著相关 (χ2 =12 86 ,P <0 0 1)。结论 :HBV通过胎盘导致胎儿宫内感染的传播途径可通过血清直接传播 ,也可通过PBMC介导。PBMC介导的HBV宫内传播较隐匿 ,孕妇PBMCHBVDNA阳性也是HBV宫内感染的重要因素。     

HBsAg阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞乙型肝炎病毒感染状况及意义的研究

目的了解乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒(HBV)感染状况及其在HBV宫内感染中的意义.方法用原位杂交(ISH)和原位PCR(IS PCR)法对HBsAg阳性孕妇新生儿PBMC进行HBV DNA检测.用随机引物法进行地高辛-HBVDNA探针的标记和定量.结果ISH及IS PCR检测PBMC HBV DNA,探针浓度以0.6μg/ml、蛋白酶K浓度以10μg/ml、IS PCR以20个循环数为佳.HBsAg阳性孕妇新生儿中,血清HBsAg、HBVDNA均阳性者有72.73%PBMC HBV DNA阳性;HBsAg阴性、HBV DNA阳性者中,有65.91%PBMC HBV DNA阳性;血清HBsAg、HBV DNA均阴性者中,仍有15.79%PBMC中HBV DNA阳性.结论IS PCR检测对低丰度PBMC HBV DNA具有细胞内定性和定位的特点.血清HBV DNA阳性新生儿多数可检出PBMC HBV DNA,而血清HBV DNA阴性新生儿也可呈PBMC HBV DNA阳性.提示PBMC HBV感染应作为HBV宫内感染的诊断指标之一.     

HBsAg阳性孕妇细胞转运意义的研究

目的 了解HBsAg阳性孕妇细胞是否可进入胎儿血循环，探索母-儿细胞转运与乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染关系。方法 用等位基因特异性PCR(allele-specfic PCR，AS-PCR)和半巢式PCR(hemi-nPCR)技术扩增新生儿外周血中母亲-S-DNA，判定母．儿细胞转运。非条件Logistic回归模型分析母一儿细胞转运与HBV宫内感染关系。结果 以谷胱甘肽转移酶(GST)M1、血管紧张素转换酶(ACE)基因作为母亲的特异性等位基因，检测42对信息病例对中26例(61．90％。26／42)新生儿发生了母-儿细胞转运。母-儿细胞转运、孕妇外周血单个核细胞(PBMC)HBV DNA阳性是HBV宫内感染的危险因素，OR值分别为8．40(1．42～49．74)，8．78(1．23～62．69)。结论 母-儿细胞转运可能是。HBV宫内感染的重要原因，PBMC可能介导FIBV穿过胎盘屏障感染胎儿。     

母-儿细胞转运在HBV宫内感染机制中的作用

目的探索HBsAg阳性孕妇细胞是否可进入胎儿血循环,HBV通过细胞转运使胎儿发生宫内感染的机制。方法以2001年12月至2003年10月由太原市传染病院妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿各123例为研究对象。用等位基因特异性PCR(ASPCR)和半巢式PCR(heminPCR)方法检测母儿细胞转运。结果以GSTM1、ACE基因作为母亲的特异性等位基因,收集到42对信息病例对,其中26例新生儿发生了母儿细胞转运,占61.90%(2642);母儿细胞转运与HBV宫内感染显著相关(χ2=8.58,P<0.01);母儿细胞转运与新生儿PBMCHBVDNA显著相关(χ2=10.10,P<0.01)。结论母儿细胞转运是HBV宫内感染的一个原因,PBMC可能介导HBV穿过胎盘屏障感染胎儿。     

外周血单个核细胞感染乙型肝炎病毒对新生儿宫内感染的影响

目的探讨HBsAg、HBeAg阳性孕妇外周血单个核细胞(PBMC)内乙型肝炎病毒(HBV)DNA感染状况及其在宫内母婴垂直传播中的作用.方法对HBsAg/HBeAg双阳性共67对孕妇及其新生儿静脉血分离和提纯PBMC后,经抽提、纯化后的DNA进入PCR扩增反应,引物为HBV C区基因序列.结果67例HBsAg及HBeAg双阳性的孕妇中有35例(52.2%)PBMC中HBV DNA阳性,25例孕妇在血清及PBMC中均发现HBV DNA.67例新生儿有22例感染HBV DNA,感染率32.8%,其中血清HBV DNA阳性者10例,PBMC HBV DNA阳性者19例,二者均阳性者7例.结论母亲PBMC内HBV DNA阳性可能导致新生儿PBMC中HBV DNA阳性,PBMC内的HBV DNA可能是HBV母婴垂直传播的一条重要途径,同时,HBsAg及HBeAg阳性母亲若血清HBV DNA为阳性就极大增加了其新生儿感染HBV的危险性.     

胎盘凋亡及细胞转运与新生儿PBMC HBsAg关系

目的探讨胎盘凋亡及外周血单个核细胞(PBMC)母-胎转运与HBs Ag阳性孕妇新生儿PBMC HBs Ag的关系。方法用等位基因特异性PCR(As-PCR)筛选母儿信息病例对,用原位末端杂交法检测HBs Ag阳性孕妇足月胎盘凋亡指数,用免疫荧光双标法检测新生儿PBMC涂片上的HBs Ag和谷胱甘肽S转移酶(GST);采用SPSS 16.0软件进行分析。结果 86例新生儿PBMC中20例(23.26%)HBs Ag阳性,31例(36.05%)GST阳性,HBs Ag、GST共存者13例(15.12%);发生PBMC母-胎转运组的胎盘凋亡指数与未发生转运组的胎盘凋亡指数差异有统计学意义(t’=2.38,P=0.02),且胎盘滋养层细胞凋亡率高与PBMC转运相关(t=2.75,P=0.01);新生儿PBMC HBs Ag阳性组的胎盘细胞凋亡指数与阴性组的胎盘细胞凋亡指数差异无统计学意义(t=0.34,P=0.74);PBMC转运与新生儿PBMC HBs Ag阳性有关(χ2=9.48,P=0.00),发生PBMC转运的新生儿发生PBMC HBs Ag阳性的危险性是未发生PBMC转运新生儿的4.95倍(OR=4.95,95%CI=1.70~14.39)。结论妊晚期胎盘细胞凋亡增加有利于PBMC母-胎转运,感染HBV的PBMC可能通过胎盘进入胎儿血循环进而导致新生儿HBV感染。     

乙肝孕妇分娩方式与新生儿HBV宫内感染关系

目的 探讨乙型肝炎孕妇分娩方式与新生儿乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的关系.方法采用问卷调查方式收集HBsAg阳性孕妇分娩方式等资料,用酶联免疫吸附试验检测孕妇和新生儿出生24h内外周血乙肝病毒标志物,实时荧光定量PCR检测母亲和新生儿外周血HBV DNA含量.结果新生儿HBsAg阳性者101例,HBVDNA阳性者30例,二者任一项阳性者113例,宫内感染率为9.5％(113/1 191);孕妇分娩时选择阴道产582例,剖宫产609例,2组宫内感染率差异有统计学意义(x2= 18.563,P=0.001);孕妇血清HBeAg和HBV DNA均阴性、HBeAg阳性而HBV DNA阴性、HBeAg和HBV DNA均阳性时,阴道分娩组和剖宫产组新生儿宫内感染率差异均有统计学意义(x2值分别为7.382、4.919、5.364,均P＜0.05);HBsAg阳性孕妇HBV DNA含量≤103和105 ～ 107 copies/mL时的分娩方式与宫内感染均有关(x2值分别为10.777、8.450,均P＜0.05).结论分娩方式与新生儿HBV宫内感染有关,HBsAg阳性孕妇选择剖宫产可能有利于降低HBV宫内感染率.     

TLR3与外周血单个核细胞HBV宫内感染关系

目的 了解Toll样受体3(TLR3)在外周血单个核细胞(PBMC)上的表达情况,探讨TLR3与PBMCHBV宫内感染的关系.方法 巢式病例对照研究随访228例HBsAg阳性孕妇至分娩,免疫荧光双标记法检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC涂片上HBsAg及TLR3.结果 228例HBsAg阳性孕妇有64例(28.07%)PBMC HBsAg阳性;161例(70.61%)TLR3表达阳性;TLR3在PBMC HBV感染组和非感染组表达差异有统计学意义(X2=30.944,P＜0.000 1);新生儿有35例(15.35%)PBMC HBsAg阳性;HBsAg阳性孕妇PBMC上TLR3的表达与新生儿PBMCHBV宫内感染有关(X2=12.354,P＜0.000 1).结论 TLR3可能是HBsAg阳性孕妇PBMC HBV感染的一个保护因素(OR=0.181,95%CI=0.091～340);也是PBMCHBV宫内感染的保护因素(OR:0.279,95%CI=0.133～0.585).     

HBsAg阳性孕妇新生儿HBV宫内感染的影响因素研究

目的探讨HBsAg阳性孕妇新生儿发生HBV宫内感染的相关影响因素。方法以太原市第三人民医院产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿为研究对象,收集HBsAg阳性孕妇一般情况(年龄、文化程度)、分娩前HBIG注射史、家人HBV感染史、乙肝病毒标志物以及新生儿出生24小时内的乙肝病毒标志物的资料。以新生儿是否发生HBV宫内感染将379例HBsAg阳性孕妇分为两组,HBV宫内感染组36例,非HBV宫内感染组343例,进而分析HBsAg阳性孕妇的一般情况、家人感染HBV史、HBV复制状态、HBV血清标志物阳性模式及HBIG注射史与新生儿HBV宫内感染的关系。结果 (1)单因素分析显示:HBV宫内感染组与非HBV宫内感染组的HBsAg阳性孕妇年龄、HBV复制状态、HBV血清标志物阳性模式的差异均有统计学意义(P<0.05),而两组间HBsAg阳性孕妇文化程度、家人HBV感染史和HBIG注射史的差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)多因素Logistic回归分析显示:HBsAg阳性孕妇的年龄(OR=0.398,95%CI0.159～0.996)与HBeAg和HBV DNA双阳性(OR=2.539,95%CI 1.233～5.227)被引入回归方程。同时分析HBsAg阳性孕妇HBV DNA含量分级与HBV宫内感染关系的结果显示其差异有统计学意义(χ2=10.983,P=0.004),且进行趋势卡方分析后,显示HBV DNA拷贝数在>106时,HBV宫内感染率明显上升。结论 HBsAg阳性孕妇年龄(>30岁)是HBsAg阳性孕妇HBV宫内感染的保护因素,而血清HBeAg和HBV DNA均为阳性和HBVDNA拷贝数>106时,其发生HBV宫内感染的可能性较大。     

PCR法检测食品从业人员血清中的HBV—DNA与ELISA法检测结果比较

125份食品从业人员体检血清样品中, HBV 感染率为49.6% , HBV-DNA检出率为4.8% 。5 份HBsAg ( )、HBeAg ( ) 血清中检出5 份HBV-DNA ( ), HBV-DNA 检出率为100.0% ; 18份HBsAg ( )、HBeAg (- ) 血清中检出1 份HBV-DNA ( ), HBV-DNA检出率为5.56% ; 102 份HBsAg (- ) 血清未检出HBV-DNA。PCR法检测HBV-DNA比血清学方法更为敏感, 更能反映HBV的传染性     

乙型肝炎病毒DNA与血清标志物联合检测在预防医院感染中的研究

目的为预防医院感染和提高输血安全性,评估乙型肝炎病毒DNA和血清标志物联合检测的价值。方法采用免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR技术分别对医院患者和献血员的标本进行乙型肝炎病毒血清标志物和DNA含量检测。结果经ELISA法检测,346例医院患者中乙型肝炎病毒标志物阴性62份,其中呈HBV DNA阳性1例(1.6%);在300份初筛合格的献血员标本中,6例呈HBV DNA阳性(2%),其中222份ELISA法全阴性的标本检出HBV DAN阳性2例(0.9%)。结论本地区人群存在HBsAg阴性的HBV感染;乙型肝炎病毒DNA和血清标志物的联合检测,对预防医院感染和提高输血安全性有重要意义。     

乙肝病毒DNA水平与表面抗原滴度水平比较

目的 比较荧光定量PCR检测乙肝病毒与表面抗原滴度检测的结果符合率，探讨PCR检测HBV DNA方法的应用前景。方法 抽取服务行业从业人员体检血清1025份，进行HBV荧光定量PCR和ELISA结果以及表面抗原滴度检测结果的比对分析，以确认标准方法。结果 荧光PCR与乙肝两对半ELISA结果相比符合一般规律，而PCR检测结果与表面抗原滴度结果无明显相关性。结论 HBV DNA定量对治疗及确认是否具传染性起指导作用，可以取代表面抗原滴度检测方法对E抗原阴性而表面抗原阳性的服务行业从业人员进行传染性判定。     

慢性乙肝患者口腔隐血与唾液HBV DNA水平的关系

目的：探讨不同口腔隐血状况下慢性乙肝患者唾液HBV DNA的阳性率和病毒浓度。方法：荧光定量聚合酶反应PCR法和隐血检测研究60名慢性乙肝患者唾液中HBV DNA的检出率和病毒含量以及唾液隐血状况。结果：唾液DNA阳性率在唾液隐血阳性和弱阳性者间为62.5%,唾液隐血阴性者为63.6%。结论：慢性乙肝患者唾液中有无血液污染对唾液HBV DNA的水平无明显影响。     

孕妇携带乙肝病毒对产后母乳的影响

目的:探讨孕妇携带乙肝病毒(HBV)在产后母乳、新生儿血内HBV的携带情况。方法:符合研究标准的61例HBV携带的孕妇,分为两组。在妊娠28周、32周、36周各注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIC)200个国际单位,孕期接受治疗的31例产妇为研究组。未接受治疗的30例产妇为对照组。采用套式PCR方法。监测产后72h内母乳、新生儿血内HBV携带情况并对两组进行比较。结果:携带HBV61例中,研究组31例注射HBIC检测母乳HBV-DNA阳性的14例占45.16%(14/31),检测新生儿血HBV-DNA阴性,产生抗-HBsAg16例占51.61%(16/31);对照组30例未注射HBlC检测母乳HBV-DNA阳性的24例占(24/30),检测新生儿血HBV-DNA阴性,产生抗-HBsAg7例占23.33%(7/30);另有携带HBsAg2例占3.28%(2/30)。两组进行比较有统计学意义,P<0.05。结论:孕期HBV携带与母乳HBV携带关系密切。证明在孕期注射HBIC可以增加新生儿对HBV的免疫力,同时降低母乳、新生儿血中HBV含量。孕期没有进行HBIC治疗的新生儿对HBV免疫力较差。在孕期进行HBIC治疗是预防HBV母儿传播的有效措施。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

孕妇感染HBV对胎儿的影响及母乳喂养的研究

:[目的 ]　研究孕妇感染HBV其脐血和初乳的感染率和排毒率。 [方法 ]　应用ELISA筛选出 2 13例HBV感染孕妇 ,并用PCR和ELISA法测脐血和初乳HBVDNA和HBVM。 [结果 ]　感染孕妇HBsAg阳性率45 .0 7% ,脐血和初乳感染率以母亲大三阳组最高 ,小三阳组次之 ,单一HBsAg阳性组最低 ;排毒率顺序相同。HB sAg阴性孕妇其脐血和初乳的感染率、排毒率与母亲血中抗体种类和性质有关。 [结论 ]　脐血和初乳HBV感染与孕妇HBV感染程度有关。育龄前青年女性应作乙肝疫苗的免疫接种 ,以减少孕期HBV的感染。产后母乳喂养的选择 ,根据母亲血中HBVM决定     

HBV感染患者外周血单个核细胞HBV DNA和cccDNA的检测

目的 探讨乙型肝炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）能否感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）并进行复制。方法 选取 137例住院患者作为研究对象,采集血液标本,分离提取外周血单个核细胞,使用细胞甩片法固定细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR）和滚环扩增结合原位跨缺口原位聚合酶链式反应技术检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）;免疫组织化学染色法检测HBV DNA和HBV cccDNA表达。结果 137例标本中,68.6%（94/137）的标本经免疫组化染色后检测出HBV DNA的表达;83.9%（115/137）的标本原位杂交和滚环扩增PCR后检出HBV cccDNA阳性信号;血清HBV DNA浓度高于106 copies/ml的患者PBMC中HBV cccDNA阳性率为95.1%,低于106 copies/ml的阳性率为51.4%。结论 高浓度外周血HBV DNA是HBV感染外周血单个核细胞的危险因素,通过原位聚合酶链式反应方法能够更灵敏地检测HBV DNA和cccDNA在PBMC中的表达,为进一步研究证实PBMC感染导致HBV母婴传播途径的分子机制奠定基础。     

荧光定量PCR检测母脐血HBV-DNA与母婴传播的临床研究

目的探讨孕妇乙肝病毒含量与宫内感染的相关性及母乳喂养的临床指导。方法对我院分娩的120例HBV感染产妇,采用荧光定量PCR检测法分别检测其孕晚期的血清,产时的脐血及产后乳汁中HBV-DNA含量,同时采用酶联免疫法行脐血乙肝病毒标志物检测。结果脐血HBV-DNA含量与孕母血清HBV-DNA含量有相关性;乳汁中HBV-DNA含量与其血清中HBV-DNA含量相关,同时与血清HBeAg存在显著相关。结论宫内感染的发生率与孕妇血清HBV-DNA含量相关,孕晚期高病毒血症(>108cp/ml)与宫内感染显著相关;产妇血清高HBV-DNA含量,乳汁HBV-DNA异常(>103cp/ml)或HBeAg阳性者不适宜母乳喂养。