TRPC6在PDGF诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

 目的：探讨经典瞬时受体电位通道6 (TRPC6) 对血小板源性生长因子 (PDGF) 诱导的气道平滑肌细胞 (ASMCs) 增殖的影响。方法：组织贴块联合酶消化法培养原代大鼠ASMCs。间接免疫荧光法鉴定平滑肌细胞及检测TRPC6在ASMCs上的表达。CCK-8法检测PDGF诱导ASMCs的增殖。Real-time PCR 检测PDGF作用后TRPC6 mRNA的表达。Western blotting检测PDGF作用后TRPC6蛋白的表达。CCK-8法检测TRPC6阻断剂对PDGF 诱导ASMCs增殖的作用。结果：细胞免疫荧光显示：TRPC6广泛存在于气道平滑肌细胞。CCK-8法检测细胞的增殖发现,20 μg/L PDGF作用后 ASMCs发生增殖 (P<0.05);PDGF与TRPC6阻断剂SKF96365共同作用于ASMCs,ASMCs的增殖较单独使用PDGF组减弱 (P<0.05),且减弱的程度具有剂量及时间依赖性。Real-time PCR结果显示：PDGF分别作用于ASMCs 12 h、24 h和48 h后,TRPC6 mRNA表达与相应的对照组比较明显升高 (P<0.05)。Western blotting检测结果显示：PDGF分别作用ASMCs 24 h和48 h后,TRPC6蛋白表达与相应的对照组比较明显升高 (P<0.05)。结论：TRPC6参与了PDGF诱导ASMCs增殖的过程,PDGF促进ASMCs增殖可能与其上调TRPC6 mRNA和蛋白表达相关。     

急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

目的:研究急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及L型电压依赖性钙通道(VDCC)阻断剂硝苯地平的作用,为缺氧性肺动脉高压发病机制的进一步研究提供理论依据.方法:胶原酶消化法培养大鼠远端PVSMC,利用荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统观测急性缺氧(4％O2)、高钾(60 mmol/L KCl)溶液对PVSMC的[Ca2+]i影响及硝苯地平的干预作用.结果:对照组PVSMC的[Ca2+]i随时间变化维持基线水平;缺氧组PVSMC急性缺氧后,[Ca2+]i迅速升高并维持平台水平,△[Ca2+]i达82.83 nmol/L士23.03 nmol/L;硝苯地平干预组PVSMC予急性缺氧和5μmol/L硝苯地平干预后,[Ca2+]i升高幅度较小;高钾溶液孵育PVSMC后,[Ca2+]i迅速增高,5 μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应.结论:急性缺氧可使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与激活PVSMC的VDCC和另外的非VDCC依赖的钙通道导致细胞外Ca2+内流有关.     

TRPC6在TGF-β1诱导的体外培养肾小球足细胞损伤中的表达及其高表达对nephrin、desmin表达的影响

目的体外研究经典瞬时受体电位通道6(TRPC6)在TGF-β1诱导的肾小球足细胞损伤中的表达变化及其高表达对足细胞nephrin、desmin表达的影响。方法以肾小球足细胞株(MPC5)为研究对象,以不同质量浓度(0、4、8、12 ng/ml)TGF-β1刺激足细胞,干预72 h后用免疫荧光、Real-time PCR、Wstern blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。再将MPC5细胞分组,应用12 ng/ml TGF-β1处理各组细胞,分别于0、24、48、72 h应用免疫荧光、Real-time PCR、Western blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体p EX-3-TRPC6及对照质粒空载体p EX-3-NC转染足细胞,48 h后应用Western blot检测转染后TRPC6蛋白水平评估传染效率;同时应用免疫荧光、Real time RT-PCR及Western印迹方法检测转染后nephrin、desmin分布及表达的变化。结果与正常对照组相比,倒置显微镜下TGF-β1干预后足细胞足突融合、回缩,当TGF-β1增加至16 ng/ml时足突甚至消失。TGF-β1作用能使足细胞TRPC6表达及分布发生变化,当TGF-β1质量浓度为4 ng/ml,干预72 h后与对照组相比TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当TGF-β1质量浓度提高到为8、12 ng/ml时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P0.05),并呈剂量依赖性。应用12 ng/ml干预24 h,与对照组相比,TRPC6m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当干预时间延长至48、72 h时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P0.05),并呈时间依赖性。p EX-3-TRPC6转染48 h后足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P0.05),nephein分布未发生变化,但表达量在m RNA及蛋白水平分别下降25%及42%左右(P0.05),desmin分布发生改变,表达量在m RNA及蛋白水平分别升高132%及116%左右(P0.05)。结论 TGF-β1可诱导足细胞TRPC6分布变化且表达上调,TRPC6高表达可影响nephrin、desmin表达及desmin的分布,这可能是TRPC6参与足细胞损伤的机制之一。     

尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞内钙离子浓度及膜瞬时受体电位通道mRNA表达的影响

目的 观察尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)后细胞内基础钙离子浓度的改变及平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道(TRPC1,TPRC6)mRNA表达水平变化.方法 不同浓度尼古丁[O(对照组)、10、20、50、100μg/L]刺激大鼠气道平滑肌细胞,作用24及48 h后,采用Incyte细胞内钙浓度检测系统观察细胞内钙离子浓度的变化.提取细胞总RNA,反转录成cDNA,实时定量PCR方法检测细胞TRPC1和TRPC6 mRNA表达量变化.结果 20、50、100μg/L的尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细24和48 h后,细胞内基础钙离子浓度均较对照组明显升高[(117.99±19.39)、(122.89±17.91)、(124.70±17.93)nmol/L比(85.85±12.60)nmol/L;(142.07±18.99)、(162.27±19.91)、(207.30±26.56)nmol/L比(98.04±2.39)nmol/L,均P＜0.05].而细胞中TRPC1和TPRC6 mRNA相对浓度也均较对照组显著升高(P＜0.05),其中,100μg/L尼古丁刺激气道平滑肌细胞48 h后,细胞内基础钙离子浓度和TRPC6 mRNA相对表达量均较刺激24 h后的明显升高(P＜0.05).结论 尼古丁可能通过上调大鼠气道平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6的表达而导致大鼠气道平滑肌细胞内基础钙离子浓度增加.     

TRPC6特异性抑制剂SAR7334对宫颈癌细胞生物学行为影响的研究

目的　探讨TRPC6在宫颈癌组织中的表达及其抑制剂SAR7334对Siha（人宫颈鳞癌细胞）增殖和迁移的影响。 方法　选取2017年9月至2019年9月在十堰市人民医院确诊为宫颈鳞癌的11例病例作为实验组,对照组取同一患者正常宫颈组织,免疫印迹法和免疫荧光法等检测宫颈组织中TRPC6蛋白表达;使用20、100、1000 nmol/L SAR7334处理Siha细胞,CCK8法和Hoechst染色检测细胞增殖与凋亡;划痕实验和Transwell法验检测细胞迁移。免疫印迹法检测TRPC6通道阻断后Siha细胞自噬程度的改变。 结果　宫颈癌组织中TRPC6表达上调;与对照组相比,用100 nmol/L SAR7334阻断TRPC6后,Siha细胞的增殖和迁移减少,划痕愈合率降低,凋亡率增加（P<0.05）。TRPC6通道阻断后,Siha细胞自噬减弱。 结论　TRPC6在宫颈癌中表达上调,其抑制剂SAR7334可能通过影响细胞自噬抑制宫颈癌Siha细胞的增殖与迁移。     

始动caspase凋亡相关蛋白在大鼠肾发育中的表达

目的:探讨始动caspase凋亡相关蛋白在大鼠肾发育中的表达。方法:采用免疫组织化学与免疫印迹法,对大鼠肾发育中始动caspase凋亡相关蛋白caspase-8和caspase-9的表达进行定性和定量观察。结果:免疫组织化学结果显示caspase-8主要表达在大鼠发育肾的近端小管和远端小管,在胚期其在远端小管的表达弱于近端小管,但在生后肾发育期其在远端小管的表达强于近端小管。而caspase-9在整个肾发育期主要表达在近端小管,远端小管的表达十分微弱。免疫印迹结果显示caspase-8蛋白表达在胚期较高,从P1d开始逐渐升高,在P7d时达到顶点,随后则逐渐减弱;caspase-9蛋白表达从E18d开始逐渐升高,在P3d其表达达到顶点,随后则逐渐降低。结论:在大鼠肾发育中,近端小管的细胞凋亡与caspase-8和caspase-9的表达密切相关,而远端小管的细胞凋亡则在生后肾发育期与caspase-8的表达有关。     

TRPC6特异性抑制剂SAR7334对宫颈癌细胞生物学行为影响的研究

目的　探讨TRPC6在宫颈癌组织中的表达及其抑制剂SAR7334对Siha（人宫颈鳞癌细胞）增殖和迁移的影响。 方法　选取2017年9月至2019年9月在十堰市人民医院确诊为宫颈鳞癌的11例病例作为实验组，对照组取同一患者正常宫颈组织，免疫印迹法和免疫荧光法等检测宫颈组织中TRPC6蛋白表达；使用20、100、1000 nmol/L SAR7334处理Siha细胞，CCK8法和Hoechst染色检测细胞增殖与凋亡；划痕实验和Transwell法验检测细胞迁移。免疫印迹法检测TRPC6通道阻断后Siha细胞自噬程度的改变。 结果　宫颈癌组织中TRPC6表达上调；与对照组相比，用100 nmol/L SAR7334阻断TRPC6后，Siha细胞的增殖和迁移减少，划痕愈合率降低，凋亡率增加（P<0.05）。TRPC6通道阻断后，Siha细胞自噬减弱。 结论　TRPC6在宫颈癌中表达上调，其抑制剂SAR7334可能通过影响细胞自噬抑制宫颈癌Siha细胞的增殖与迁移。     

佛波酯敏感的PKC介导IL-6上调大鼠血管平滑肌细胞bFGF蛋白表达

目的:观察蛋白激酶C(PKC)途径在白细胞介素 6(IL-6 )上调大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)中的作用。方法:采用大鼠主动脉贴块法培养VSMC,以佛波醇 12,13-二丁酸盐预耗竭细胞内PKC,Western免疫印迹法观察IL-6对VSMCbFGF和成纤维细胞生长因子 1型受体蛋白表达的影响。结果:IL-6在 0-10 0g/L剂量范围内上调bFGF蛋白,并呈量效关系,表达高峰为 2 4h。细胞内佛波酯敏感的PKC预耗竭后该上调作用显著下降。IL-6对VSMC成纤维细胞生长因子 1型受体蛋白表达无影响。结论:IL-6上调大鼠VSMCbFGF蛋白水平,上调作用呈佛波酯敏感的PKC依赖性.     

大鼠大脑中动脉缺血后海马星形胶质细胞反应的研究

目的:观察大鼠大脑中动脉缺血后皮层损伤侧海马星形胶质细胞反应的变化。方法:采用大鼠大脑中动脉阻塞再灌流模型,应用免疫印迹和免疫组织化学方法测定脑缺血后3 d、7 d以及30 d皮层损伤侧海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,观察星形胶质细胞增殖的变化。结果: GFAP免疫组化结果显示,脑缺血后7d皮层损伤侧海马CA1、CA2区星形胶质细胞数量较假手术组增加且胞体增大;脑缺血后30 d皮层损伤侧海马CA1、CA2区呈胶质疤痕样改变。同时,免疫印迹法显示脑缺血后7 d皮层损伤侧海马GFAP表达增强;脑缺血后30 d皮层损伤侧海马GFAP表达增高更加明显。此外,免疫印迹法显示脑缺血后3 d皮层损伤侧海马PCNA蛋白表达水平升高;脑缺血后7 d PCNA蛋白表达水平达到峰值;脑缺血后30 d,PCNA蛋白表达水平降低,但仍高于假手术组。结论: 大鼠大脑中动脉缺血后可引起其皮层损伤侧海马星形胶质细胞过度反应和增殖。     

砷染毒对大鼠睾丸凋亡诱导因子表达及生精细胞凋亡的影响

目的:探讨砷染毒对大鼠睾丸凋亡诱导因子(AIF)表达及生精细胞凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠被随机分为对照组和染砷组。采用自由饮用方式进行连续染毒6个月。采用免疫印迹及实时荧光定量PCR检测AIF表达水平;采用TUNEL法观察生精细胞凋亡的情况。结果:免疫印迹及实时荧光定量PCR结果显示,与对照组比较,染砷组大鼠睾丸内AIF蛋白及mRNA表达水平均显著增高。TUNEL法检测结果显示与对照组比较,染砷组生精上皮凋亡细胞平均灰度值显著增高。结论:砷染毒时AIF介导的非caspase依赖性凋亡途径可能参与了大鼠生精细胞凋亡。