Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

hMS H2重组质粒对人卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响

目的：研究hMSH2重组质粒对卵巢癌顺铂敏感性方面的影响。方法：构建重组真核表达质粒pCAN－hMSH2,通过酶切及测序法对重组质粒进行鉴定。采用脂质体转染技术对卵巢癌耐药细胞SKOV3／DDP进行瞬时转染,对照组为未转染细胞和SKOV3敏感细胞;hMSH2在细胞内的表达变化由Western blotting和RT－PCR进行检测;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法对细胞的顺铂敏感性进行检测;耐药细胞的凋亡情况通过Hoechst染色法检测。结果：重组质粒pCAN－hMSH2转染进SKOV3／DDP后,经RT－PCR和Western blotting检测证实转染成功,hMSH2的表达得到增强;MTT结果提示转染后的卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性明显增强;Ho-echst染色发现,转染后耐药细胞的凋亡明显增强。结论：hMSH2基因转染后能提高其在SKOV3／DDP细胞中的表达,增强SKOV3／DDP细胞对顺铂的敏感性,促进在顺铂作用下的凋亡。     

顺铂诱导卵巢癌耐药细胞系A2780/DDP凋亡的时间和剂量依从性

目的探讨不同浓度顺铂作用不同时间诱导敏感和耐药卵巢癌细胞系发生凋亡变化规律和凋亡途径相关蛋白的表达。方法选择卵巢癌顺铂耐药细胞系A2780/DDP和敏感细胞系A2780为研究对象。在细胞培养基础上,运用MTT比色法、原位标记法、常规免疫组化和蛋白印迹等方法,观察不同剂量的顺铂(5、10、20、40μmol/L)和作用不同时间(24、48、72h)对A2780和A2780/DDP细胞凋亡的影响和此动态变化过程中半胱天冬氨酸蛋白酶2(Caspase2)和3(Caspase3)表达。结果顺铂对A2780和A2780/DDP细胞系凋亡的诱导呈时间和剂量依从性。细胞凋亡蛋白Caspase2和Caspase3的活化促进顺铂诱导的凋亡,其表达呈现出对顺铂作用时间和剂量的依从性。结论(1)在顺铂耐药机理中,药物在体内分布和代谢,对血药有效浓度的影响和细胞对药物排斥引起顺铂进入细胞存在一定的阻碍可能是降低顺铂敏感性的因素。(2)Caspase2和caspase3蛋白活化延后和活性降低可能是影响耐药A2780/DDP细胞凋亡的原因。     

DLC1基因对人卵巢癌细胞OVCAR-3顺铂耐药性的影响

背景与目的:有研究发现,肝癌缺失基因1(DLC1)在多种肿瘤中低表达或不表达,其通过调节黏着斑激酶(FAK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等影响肿瘤细胞的凋亡.而对于DLC1在卵巢癌中的表达及作用等的研究甚少,本实验采用DLC1基因转染该基因表达缺失的人卵巢癌多药耐药细胞系OVCAR-3,观察转染前后该细胞对顺铂耐药性及FAK、p38MAPK的变化.方法:将OVCAR-3细胞分为3组,空白组为未经处理的OVCAR-3细胞,阴性对照组转染空质粒pEGFP-C3,实验组转染重组质粒pEGFP-C3-DLC1.RT-PCR和Western blot检测各组细胞中DLC1基因和蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50),Western blot观察FAK、p38蛋白及其磷酸化水平的变化,流式细胞仪测定顺铂处理前后各组细胞凋亡率及周期分布改变.结果:DLC1基因和蛋白在实验组表达而空白对照组和阴性对照组均未见表达,实验组细胞与其他两组细胞相比,对顺铂的IC50较低(4.02 vs 4.99/4.90 μmol/L,P＜0.01),p-p38蛋白表达上升而p-FAK蛋白表达下降(3.02 vs 1.52/1.61,3.13 vs 9.03/8.99,P＜0.01),顺铂处理前后实验组与其他两组细胞相比凋亡率增加(8.97% vs 1.81%/1.95%,30.68% vs 18.03%/20.33%,P＜0.01),G1期细胞比例增加(65.80% vs60.82%/59.80%,66.48% vs 55.42%/53.94%,P＜0.05).结论:转染DLC1基因可使OVCAR-3G1期细胞比例及凋亡率升高,对顺铂敏感性增加,该作用可能依赖于细胞内外源性DLC1基因的表达、p-FAK表达降低和p-p38表达增强.     

MACC1基因干扰对卵巢上皮性癌细胞增殖和顺铂耐药的影响北大核心CSCD

背景与目的:有研究发现,结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)在多种肿瘤中高表达,其通过调节细胞外信号激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2信号通路影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程。而对于MACC1在卵巢癌中的作用研究甚少。本研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌耐药细胞中MACC1基因的表达,并探讨MACC1基因表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:前期设计的针对MACC1 mRNA的小发卡状RNA(shRNA)转染卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP细胞,RT-PCR及Western blot检测MACC1 mRNA和蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝法检测转染前后SKOV3/DDP细胞的增殖及对顺铂的半数抑制浓度(IC50),流式细胞仪测定顺铂处理前后各组细胞凋亡率。Western blot检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的变化。实验分3组:空白组为未经处理的SKOV3/DDP细胞,阴性对照组转染空质粒p-super-EGFP-1,实验组转染重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA。结果:与其他两组细胞相比,实验组细胞MACC1 mRNA及蛋白降低,对顺铂的IC50较低(26.094 vs 47.501/47.089μmol/L,P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达下降(0.3979 vs 0.6712/0.6681,P<0.05),顺铂处理前、后凋亡率增加(1.32%vs 0.66%/0.48%,P<0.05;36.70%vs 18.53%/16.60%,P=0.000)。结论:MACC1基因表达下调能在一定程度上恢复SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,可能与ERK1/2通路有关。     

雷帕霉素增强卵巢癌细胞系对顺铂敏感性的机制研究

目的：研究雷帕霉素对卵巢癌细胞系顺铂敏感性的影响,以及PI3K/AKT/mTOR信号通路（简称mTOR信号通路）与卵巢癌细胞系顺铂耐药的相关性;初探雷帕霉素增强卵巢癌细胞系顺铂敏感性的分子机制。方法采用CCK-8法检测卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP的耐药指数（resistance index,RI）、细胞增殖抑制率;采用克隆平板实验观察不同用药方案对卵巢癌顺铂非耐药细胞系及SKOV3细胞系两种细胞系克隆形成的影响;采用蛋白质印迹法（Western blot）检测两种细胞系的蛋白表达差异。结果①SKOV3/DDP细胞系的RI为6.10,属中度耐药。②在SKOV3细胞系中,顺铂联合雷帕霉素作用24 h、48 h后的细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）,两组间的72 h细胞增殖抑制率无明显的统计学意义（P＞0.05）;顺铂联合雷帕霉素作用于SKOV3/DDP细胞系24 h、48 h、72 h后的细胞增殖抑制率均明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。③雷帕霉素联合顺铂作用于SKOV3细胞系4 h后,其克隆形成抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。④SKOV3/DDP细胞系比SKOV3细胞系p-mTOR、p-AKT的表达升高,而mTOR、AKT的表达则相似。⑤联合用药组比单用顺铂组的PARP断裂增加。⑥雷帕霉素作用SKOV3细胞系24 h ,BCL2表达下调,LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ转化增加;在SKOV3/DDP细胞系中未发现这两种作用。结论①在体外培养条件下,雷帕霉素能增强SKOV3及SKOV3/DDP细胞系对顺铂的敏感性。②mTOR信号通路激活可能在卵巢癌细胞系顺铂耐药机制中起重要作用。③雷帕霉素增强SKOV3细胞系对顺铂敏感性的分子机制包括：增强顺铂所致的DNA断裂、下调抗凋亡蛋白BCL2及引起细胞自噬;雷帕霉素增强SKOV3/DDP对顺铂敏感性分子机制可能与增强顺铂所致的DNA断裂有关。     

沉默ATF5对卵巢癌细胞顺铂敏感性影响的研究

目的:探讨显性负抑制人转录激活因子5(ATF5)对卵巢癌细胞SKOV-3顺铂敏感性的影响。方法:采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测不同卵巢癌细胞系ATF5的表达。采用脂质体介导法将真核表达质粒pLeGFP-C1-NT-Azip-ATF5和pLeGFP-C1分别转染SKOV-3细胞,同时设空白对照组;于转染后24h给予不同浓度的顺铂作用48h,通过MTT法测定细胞增殖抑制率;转染后24h给予4μmol/L顺铂作用0、12、24和48h,通过流式细胞术和蛋白质印迹法分别检测细胞凋亡和Bcl-2蛋白的表达。结果:ATF5在3种卵巢癌细胞系中均有不同程度的表达,其中SKOV-3细胞系表达最高;显性负抑制SKOV-3细胞内源性ATF5的功能联合顺铂作用后,与非特异性转染组和空白对照组相比,特异性转染组细胞增殖明显受抑制,顺铂的IC50由5.4μmol/L下降为3.6μmol/L;顺铂作用24h,特异性转染组细胞凋亡率显著升高,约为非特异性转染组3倍,抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达明显下降,P<0.05。结论:显性负抑制ATF5的表达可明显增强卵巢癌细胞系SKOV-3对顺铂的化疗敏感性,其协同顺铂诱导细胞凋亡的机制可能与Bcl-2的下调相关。     

凋亡相关蛋白的表达及Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

背景与目的:以顺铂为基础的化疗是卵巢癌治疗的重要组成部分,对顺铂的耐药是卵巢癌治疗失败的原因之一。本研究探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株中凋亡相关蛋白表达及caspase-3活性与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:采用Westernblot法分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中凋亡相关蛋白bcl-2、bcl-xL、bax、bcl-xS的表达,caspase-3活性和其底物多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的变化,并应用流式细胞仪检查不同浓度顺铂作用COC1和COC1/DDP细胞后的细胞凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,bcl-2和bcl-xL的表达明显高于COC1细胞,bax的表达无明显改变,bcl-xS在COC1和COC1/DDP细胞中均无表达。用顺铂处理后,COC1/DDP细胞中caspase-3活性、PARP裂解片段和凋亡率较COC1细胞均明显降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论:人卵巢癌细胞对顺铂产生耐药可能与肿瘤细胞内凋亡抑制蛋白过度表达、caspase-3活性下降有关,而与凋亡诱导蛋白的表达无关。     

靶向GLI1基因增强卵巢癌细胞化疗敏感性的实验研究

目的探讨载体表达的小干扰RNA(siRNA)影响卵巢癌耐药细胞株GLI1基因的表达,促进凋亡并逆转其顺铂耐药的可行性。方法体外构建GLI1小发夹状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/DDP细胞。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GLI1 mRNA的表达;使用免疫细胞化学法(ICC)检测GLI1蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果 GLI1 shRNA转染组细胞GLI1 mRNA的表达与其他两组相比明显减弱(P0.01),GLI1蛋白表达明显下调(P0.01);顺铂敏感性比正常对照组提高了约2.5倍;流式细胞仪检测结果显示:顺铂作用24 h后,特异性转染组细胞周期分布发生明显改变,G_0/G_1期细胞比例增多,而S期细胞比例减少,凋亡率显著升高。结论针对GLI1合成的siRNA能够有效地抑制GLI1 mRNA和蛋白的表达,促进卵巢癌耐药细胞凋亡并能恢复其对顺铂的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性。     

透明质酸寡糖调节A549/DDP多药耐药作用的研究

目的:通过研究透明质酸寡糖对人肺腺癌细胞系A549/DDP的P糖蛋白和多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)表达的影响,探讨透明质酸在引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法: 将CD44单抗或透明质酸寡糖与A549/DDP细胞共培养48小时,放免法检测培养基中细胞所分泌透明质酸的含量,流式细胞仪检测经上述处理的A549/DDP表面MDR1 、MRP、LRP的表达率,MTT法检测在不同浓度顺铂作用下,各组细胞的存活率.结果: 经透明质酸寡糖处理后A549/DDP,分泌透明质酸较未处理组明显减少(P<0.05);且细胞表面与多药耐药相关的MDR1 、MRP、LRP的表达率均降低(P<0.05).另外,处理后的细胞,在不同浓度顺铂作用时,细胞凋亡率明显增加.结论: 体外条件下,透明质酸寡糖能逆转A549/DDP的耐药.