一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ

目的 探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构。方法 从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，并进行电镜观察。从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA，并进行链型分析。对pCTAK进行酶谱分析。用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测，用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测；用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329，将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29，用GM1－ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达。对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序，并用DNASTAR软件和BLAST算法，在国际互联网上对测序结果进行序列分析。结果 发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK，它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中；酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱，在CTX元件中相当保守的酶切位点：BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ，在pCTAK中没有切点。ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性，RS1探针杂交呈阳性；pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性。pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT。从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，电镜观察并计算其直径大小为7nm左右。其全基因组大小为8.5kb，为单链DNA。结论 发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ。     

霍乱弧菌溶原性噬菌体CTXΦ的氯霉素抗性基因标记及诱导

目的　对携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体CTXΦ进行遗传标记 ,以深入研究CTXΦ对霍乱弧菌的转染机制。方法　将CTXΦ基因组中ctxAB的上下游同源序列连接到cat基因的两侧 ,然后通过自杀质粒介导的DNA同源重组技术将霍乱菌株N16 96 1染色体上CTXΦ基因组中的ctxAB基因缺失掉 ,替换以氯霉素抗性基因 ,对CTXΦ基因组进行遗传标记 ,然后用丝裂霉素C诱导这种经抗性基因标记的噬菌体 ,再利用它对古典型霍乱弧菌的转染检测活性。结果　获得了ctxAB缺失、带有cat遗传标记的重组菌株N Φc;诱导出的CTXΦc噬菌体颗粒成功感染了霍乱菌株 1119。结论　N Φc中的CTXΦ带有了氯霉素抗性标记 ,诱导出具有感染活性的CTXΦc可用于研究毒力基因的水平转移     

霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因 CTXФ基因组的复制功能研究

引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素(CT)的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中,发现一种新的不含ctxAB的CTXФ基因组,其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXФ基因组的相应序列无明显同源性,其他的基因很保守,也不含ctxAB基因,命名为nct-CTXO139Ф.     

临床来源nct-CTXΦ样霍乱弧菌基因的多样性分析

目的了解临床来源霍乱弧菌nct-CTXΦ(不含霍乱毒素基因的CTXΦ)样基因特征。方法对6株于2000-2004年自杭州散发腹泻患者分离的ctxA-、tcpA O1群霍乱弧菌核糖体基因分型,PCR检测zot、ace、cep基因及串联CTXΦ基因组拷贝间的相邻片段;以zot、ace、cep基因探针South- ern blot分别检测nct-CTXΦ样基因的PstⅠ、HindⅢ、MluⅠ、BglⅡ酶切及HindⅢ、MluⅠ双酶切的限制性酶切长度多态性,结合拷贝间相邻片段HindⅢ酶切位点分析,构建nct-CTXΦ样基因组物理图谱。结果6株O1群霍乱弧菌中,核糖体基因分型为2种型别;1株无CTXΦ或nct-CTXΦ样基因组,5株存在nct-CTXΦ样基因组,且此5株菌株中存在3种类型nct-CTXΦ样基因组组成,分别为单拷贝长约6 kb串联双拷贝、单拷贝长约5.8 kb的串联双拷贝和串联4拷贝(2个单拷贝长约6 kb,另2个单拷贝长约5.8 kb)。结论nct-CTXΦ霍乱弧菌可能具有引起腹泻的能力;临床和环境来源的霍乱弧菌中存在着一类多样性的nct-CTXΦ样噬菌体家族。     

霍乱弧菌不携带毒素基因的溶原性噬菌体nct-CTXΦ基因组RS区具有复制与整合功能

目的 研究霍乱弧菌中不携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌CTXΦ基因组（nct-CTX^classΦ）的RS区的复制与整合功能。方法 将这种噬菌体基因组的RS区克隆到不能在霍乱弧菌中复制的自杀质粒载体中，经接合转入含CTXΦ的整合位点attRS、但不含CTXΦ基因组的O1群El Tor型和O139群菌株中，分析含RS的重组自杀质粒在这些被接合菌株中的存在形式。结果 克隆了RS区的重组自杀质粒高频接合入受体菌中，在这些被接合菌株中既发生了染色体整合，同时又以质粒的形式存在于菌细胞内。结论 霍乱弧菌不携带霍乱毒素基因的CTXΦ基因组的RS区仍具有整合与质粒复制功能，可介导该基因组的复制与染色体整合。     

霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组

目的近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ｃｔｘＡＢ由其溶原性噬菌体ＣＴＸΦ编码,这种丝状噬菌体可携带ｃｔｘＡＢ传递给无毒素基因的霍乱菌株。研究认为ｃｔｘＡＢ基因与ＣＴＸΦ基因组中的其它基因是严格共存的。然而在本实验室研究中,于不含ｃｔｘＡＢ基因的ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌（ＥＶＣ）中发现部分菌株含有ＲＳ基因同源序列,为此对这些菌株作ＣＴＸΦ基因组的进一步研究。方法以ＣＴＸΦ基因组中的ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐ和ＲＳ１结构基因制备探针,对ｃｔｘＡＢ－菌株染色体作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,并用ＰＣＲ方法检测ＣＴＸΦ的感染受体毒素共调菌毛（Ｔｃｐ）的ｔｃｐＡ基因。结果发现有４株分离自河水的霍乱毒素基因阴性ＥＶＣ菌株仍含有溶原噬菌体ＣＴＸΦ的基因组,为ｃｔｘＡ－ｃｔｘＢ－ｚｏｔ＋ａｃｅ＋ｃｅｐ＋ＲＳ＋菌株,另有一株分离自病人的ＥＶＣ菌株仅表现为ＲＳ＋。这些菌株均含ｔｃｐＡ基因。结论ｃｔｘＡＢ基因并不一定与ＣＴＸΦ其它基因共存于一个菌株中,发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体ＣＴＸΦ基因组内可以不携带毒素基因ｃｔｘＡＢ的存在形式     

O139群霍乱弧菌染色体中整合两种CTXΦ前噬菌体基因组的多样性

目的：研究同时携带两种CTXφ基因组的O139群霍乱弧菌中CTXφ基因组的多样性。方法:Southern blot检测分离自福建的部分O139霍乱弧菌菌株中ctxAB和zot基因的多态性，然后选取ctxAB和zot基因拷贝数差异较大的3株菌，扩增其调控抑制基因rstR基因片段，克隆并进行序列测定、分析。结果：此3株菌染色体zot杂交条带多于ctxAB2－5条，提示1个菌株染色体上有编码ctxAB的CTXφ以及不编码ctxAB的CTXφ两种基因组。以保守区设计的引物扩增此3株菌的rstR区，均得到2条大小 不同的条带，分别克隆后进行测序，经GenBank同源性检索，发现在此3个菌株染色体中分别有来自El Tor型的CTX^ETφ与不编码ctxAB的nct-CTX^0139φ、来自加尔各答型的CTX^calcφ与nctCTX^0139φ、以及CTX^ETφ与新报道的一种具有独特rstR序列的CTXφ类基因组两两共存于1个菌株染色体上。这3个菌株还具有不同的16S核糖体基因杂交图谱。结论：不同rstR序列的CTXφ基因组可以共存于1个菌株染色体中，提示CTXφ家族进化过程中的复杂分化，CTXφ家族在不同霍乱菌株间的出现及传递、在霍乱弧菌菌株的变异分化中具有相关性。     

编码霍乱毒素的霍乱弧菌溶原性噬菌体CTXΦ研究概况

人类历史上已有七次世界性的霍乱大流行 ,均由O1群霍乱弧菌的两个生物型 (古典型和ElTor型 )所引起。 1992年 10月在印度和孟加拉国首次发生了由非O1群霍乱弧菌———O139群霍乱弧菌引起的霍乱暴发和流行。在南亚、非洲和拉丁美洲的部分地区 ,霍乱已呈现地方性流行 ,季节性暴发很普遍 ,与贫困和较差的卫生状况密切相关〔1〕。霍乱弧菌在小肠定居、繁殖和分泌霍乱毒素(CT)。CT由ctxAB基因编码 ,ctxAB在不同菌株中拷贝数可有不同 ,古典型菌株中均为双拷贝 ,在ElTor菌株则为单拷贝或多拷贝串联排列。Meklalanos〔2〕研究认为这种串联的…     

O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXФ的诱导及转染性研究

目的　探讨新出现的O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXΦ的来源及其是否可产生感染性的噬菌体颗粒 ,从而造成毒素基因的水平转移。方法　用DNA破坏剂丝裂霉素C诱导噬菌体CTXΦ基因组被四环素抗性基因标记的O139菌株BJ30 ,继而体外转染古典型标准菌株 5 6 9B和O395 ,对获得的四环素抗性的转导菌株进行转染噬菌体基因组的鉴定。结果　序列同源性分析表明 ,BJ30菌株中的rstR基因与O1群ElTor型菌株的rstR基因完全一致 ;丝裂霉素C诱导获得了感染性噬菌体颗粒 (CTX TcΦ) ,并成功感染O1群霍乱弧菌 5 6 9B和O395 ,转染率分别为 1.0 4× 10 - 4 和 3.2 7× 10 - 6 。结论　O139群霍乱弧菌能产生感染性CTXΦ颗粒 ,ElTor型菌株不是产生CTXΦ的唯一来源。     

CTXΦ在霍乱弧菌两个染色体上的整合分析

目的 研究CTXΦ是否可以在没有TIE（toxin-linked cryptic）因子的非产毒霍乱弧菌染色体上整合，以及是否可以在霍乱弧菌小染色体上整合。方法 筛选染色体上没有整合CTXΦ及TIE基因组的霍乱菌株（CTX^- TLC^-），检测这类菌株染色体上是否有类似的CTXΦ染色体整合位点attB。以含有CTXΦ的RS区及整合位点的自杀质粒pKRSn与pKRSe结合转移到CTX^-TLC^-及CTX^- TLC^＋菌株，观察染色体整合情况，并分析整合位置的序列。结果 CTX^-TLC^-菌株存在与CTXΦ染色体整合位点相似的序列。在CTX^-TLC^-菌株当中，CTXΦ基因组存在于小染色体上：自杀质粒pKRSn与pKRSe可以在TLC^＋及TLC^-菌株的大染色体发生整合，也可以在TLC^-菌株的小染色体发生整合。结论 CTXΦ可以在霍乱弧菌的两条染色体上通过高度相似或一致的attB位点发生整合，另外也提示TIE在CTXΦ的大染色体整合中可能发挥作用。     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.     

CTXФ在霍乱弧菌两个染色体上的整合分析

目的 研究是否可以在没有TLC(toxin-linked cryptic)因子的非产毒霍乱弧菌染色体上整合,以及是否可以在霍乱弧菌小染色体上整合.方法 筛选染色体上没有整合CTXФ及TLC基因组的霍乱菌株(CTX-TLC-),检测这类菌株染色体上是否有类似的CTXФ染色体整合位点attB.以含有CTXФ的RS区及整合位点的自杀质粒pKRSn与pKRSe结合转移到CTX-TLC-及CTX-TLC+菌株,观察染色体整合情况,并分析整合位置的序列.结果 CTX-TLC-菌株存在与CTXФ染色体整合位点相似的序列.在CTX+TLC-菌株当中,CTXФ基因组存在于小染色体上.自杀质粒pKRSn与pKRSe可以在TLC+及TLC-菌株的大染色体发生整合,也可以在TLC-菌株的小染色体发生整合.结论 CTXФ可以在霍乱弧菌的两条染色体上通过高度相似或一致的attB位点发生整合,另外也提示TLC在CTXФ的大染色体整合中可能发挥作用.     

El Tor型霍乱弧菌口服活疫苗候选株IEM108的构建

目的 构建能够诱导抗菌抗毒素免疫和抵抗CTXΦ转染的霍乱弧菌生物安全性口服活疫苗候选株。方法 以不产毒的EI Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEMl01为出发菌株，以管家基因thyA为选择压力，在IEMl01的thyA基因缺失株IEMl01-T中，通过质粒．染色体致死平衡系统表达霍乱毒素B亚单位基因ctxB和介导CTXΦ噬菌体免疫的rstR基因。在家兔模型中，通过检测血清杀弧菌抗体和抗CTB的IgG抗体来评价该新建疫苗候选株的免疫原性；以对家兔攻毒试验后肠段积液量来评价其保护力。结果 含ctxB、rstR和大肠杆菌来源的thyA基因的重组质粒在：IEMl01-T中稳定存在，GMI-ELISA检测ctxB基因能够很好表达。动物试验表明，该新建疫苗候选株能刺激机体产生高滴度的血清杀弧菌抗体和抗CTB IgG抗体，能较好抵抗至少4μg纯品CT和不同毒株的攻击。结论 应用质粒．染色体致死平衡系统构建了能抵抗CTXΦ转染和稳定表达ctxB的生物安全性抗菌抗毒口服活疫苗候选株，其在家兔模型中有较好的免疫原性和保护力。     

O139霍乱弧菌CTAKΦ的基因水平转移的研究

目的 探讨CTAKΦ介导的霍乱弧菌毒素基因水平转移。方法 用抗生素敏感试验筛选出几组基因水平转移试验组合的供、受体菌，以便于用抗性筛选来确定基因转移的情况。在这几组试验组合中分别用接合转移、上清水平转移、培养液水平转移的方法，检查供体菌将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌的能力。结果 供体菌FJ97129、DX29能通过多种转移方式，以很高的频率将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌HK42、XJ93172、GD3188、7763、569B和94001；而受体菌IEM101对CTAKΦ有一定的抗感染能力。结论 CTAKΦ能够介导霍乱弧菌中霍乱毒素基因的水平转移。     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对O1群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。 方法根据O1群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O1和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用便携式Smartcycler Ⅱ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。 结果实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌的检测敏感度为1．0×10^2拷贝每反应体系;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1．0×10^1 pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2h内完成。 结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。     

El Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEM108抗CTXΦ转染的生物安全性试验

CTXΦ超免疫是由rstR介导的 ,rstR抑制后转染进入CTXΦ中rstAB基因表达所引发的基因组复制与整合。Davis等〔1〕 以rstR抑制携带CTXΦ基因组的重组自杀质粒在菌细胞内的复制来研究rstR的作用 ,我们简化了rstR对rstAB转录表达抑制的实验模型 ,采用比较克隆有RS区的重组自杀质粒接合转移频率的方式来进行安全性评价。将EVC的RS序列克隆到自杀质粒pKTN70 1中 ,该自杀质粒本身在霍乱弧菌中不能复制 ,由于RS区内含与质粒复制起始功能相类似的区域〔2〕,因此 ,重组自杀质粒能在霍乱弧菌中复制。若该菌株内先存在功能性的rstR ,则抑制…     

ST239-spa t037 MRSA与ST239-spa t030 MRSA的比较基因组分析

目的 寻找金黄色葡萄球菌基因组进化相关的关键基因.方法 利用含有2457个金黄色葡萄球菌基因的比较基因组芯片对23株不同时间、不同地点分离的ST239-spa t037和ST239-spa t030的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)进行比较基因组分析,鉴定差异区段,并利用PCR验证差异基因.结果 通过对北京地区MRSA早期克隆(ST239-spat037,1994-1998年)和晚期克隆(ST239-spa t030,2000-2006年)的比较基因组分析,发现4个基因簇仅存在于晚期克隆,主要定位于3个已知的基因组岛(vSa4,前噬菌体ΦSa1和ΦSa3).不同地区的ST239-spa t030 MRSA的比较基因组分析发现:在不同地区的菌株中有8个基因存在差异.结论 北京地区MRSA从t037进化到t030的过程中获得3个基因组岛(vSa4、前噬菌体ΦSa1和ΦSa3),从而增强了ST239-spa t030 MRSA的毒力和适应性,对其取代ST239-spa t037 MRSA发挥关键作用.     

CTX—M型阴沟肠杆菌的基因克隆及原核表达产物特性研究

目的对阴沟肠杆菌所产CTX－M型β－内酰胺酶进行基因克隆、原核表达重组质粒的构建及其特性研究。方法以产CTX－M型β－内酰胺酶的阴沟肠杆菌45号基因组DNA为模板，设计两对引物PCR扩增CTX－M、将其克隆入pGEM－T载体后测定该核苷酸序列，再将CTX－M基因克隆到pGEX－6P－3表达质粒并转入感受态BL21．选择阳性菌落进行药物敏感试验和酶动力学检测。结果PCR扩增出大小为876bp和1067bp的基因片段，与GenBank上CTX—M－9和CTX—M－3酶的基因序列同源性为100％。CTX－M－3型重组菌株药敏试验结果与原菌株相比，对青霉素类和头孢噻肟具有明显的水解作用，第三、四代头孢菌素对之较为稳定，动力学结果与酶稳定性结果基本一致。结论重组质粒pGEX－6P－3／CTX—M构建成功，CTX—M－3型重组菌株与原菌株比较，对β－内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加，亲和力下降。     

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

宋内痢疾菌无毒株S7表达霍乱弧菌O抗原及霍乱毒素B亚单位工程菌的构建

以宋内氏痢疾菌无毒株S7作为受体,将含有编码霍乱弧菌O抗原及霍乱毒素B亚单位基因的质粒转移入其中,构建成重组菌株S7COB。质粒电泳图谱显示重组株中存在被转移的外源质粒。重组株的生化特性和毒力表型与受体相同。菌体凝集和全菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)证明在重组株的菌体表面同时表达了霍乱弧菌和宋内氏痢疾菌的O抗原。GM1-ELISA表明该重组株能在细胞内表达霍乱毒素B亚单位。以5亿、10亿的重组株免疫LIBP品系小鼠,免疫小鼠对宋内氏毒株S63攻击的保护率为70％～100％,对霍乱弧菌毒株569B攻击的保护率为30％～54％。