小鼠肝细胞核磷酸化蛋白质组的提取和双向电泳分离

目的提取小鼠肝细胞核磷酸化蛋白并利用双向凝胶电泳分离小鼠肝细胞核磷酸化蛋白。方法提取小鼠肝细胞核蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂纯化出磷酸化蛋白后,进行一维等电聚焦分离和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并挑选其中一个蛋白斑点进行质谱分析。结果成功提取了肝细胞核磷酸化蛋白,通过双向凝胶电泳分离技术成功建立了小鼠肝细胞核磷酸化蛋白质组图谱。质谱鉴定结果证实被挑选蛋白斑点是小鼠核磷酸化蛋白。结论磷酸化蛋白纯化技术结合二维凝胶电泳分离技术是研究肝细胞核磷酸化蛋白质组的有效方法,为进一步全面研究和鉴定小鼠肝细胞核磷酸化蛋白的功能打下了基础。     

蛋白质组学研究方法学进展

蛋白质组学是针对蛋白质组研究的一门新兴学科,近年来发展迅速,其相应方法学也取得很大进 展。文章介绍了近年来差异表达蛋白质研究的方法学进展,包括双向凝胶电泳技术、凝胶内差别电泳、同 位素亲和标签技术、蛋白质芯片和蛋白质组的多维液相分离-质谱分析等方法。     

蛋白质组学技术在心血管疾病中的应用

蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新兴科学,主要采用双向凝胶电泳、质谱分析、蛋白质芯片和生物信息学等高通量、自动化技术研究组织或细胞全部蛋白质变化。蛋白质组学技术已广泛应用于心力衰竭、冠心病、高血压、心肌肥厚、心肌病和心肌缺血再灌注等心血管疾病的发病机制研究,发现了以蛋白质组变化为特征的新发病机理,为药物防治提供了新的思路和方法。 基金     

慢性肾小球肾炎肾阴虚证血浆蛋白质双向凝胶电泳分析

目的初步观察慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质组的变化与表达差异,为进一步探讨肾阴虚证的发生机制奠定基础。方法采用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者、肾阳虚证患者和正常人的血浆总蛋白,银染显色;PDQest软件对凝胶图像进行定性定量差异表达分析;从中选取差异表达蛋白质斑点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析,获取肽质量指纹图谱（PMF）;通过Mscot-Wizard软件进行数据库搜索,鉴定蛋白质。结果与正常人和慢性肾小球肾炎肾阳虚证患者相比,在慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质双向凝胶电泳图谱中绝对高表达的蛋白质斑点有80个,绝对低表达的蛋白质斑点有42个;定性差异表达分析发现,在慢性肾小球肾炎肾阴虚证患者血浆蛋白质双向凝胶电泳图谱中特异出现的蛋白质斑点有2个,缺失的蛋白质斑点有13个。结论同病异证患者血浆中存在差异表达蛋白质,利用蛋白质组学技术有望对中医证候的发生机制进行阐释。     

老年性痴呆大鼠血清的蛋白质组学研究

目的以老年性痴呆（AD）大鼠为研究对象,应用蛋白质组学方法在血清中筛选与AD密切相关的蛋白质,为研究AD的发病机制提供理论支持。方法通过Morris水迷宫记忆行为学筛选符合痴呆标准的AD大鼠模型,收集AD组大鼠及假手术组大鼠的血清后,去除血清中的高丰度蛋白质并进行蛋白质浓度的测定,之后进行双向凝胶电泳,挑选差异最为明显的蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析,经数据库查询,鉴定差异蛋白质。结果经观察二维凝胶电泳图谱后,发现AD组大鼠与假手术组大鼠的血清中共有10个差异明显的蛋白质点,选取了2个最为明显的蛋白质点进行鉴定,分别为：血浆视黄醇结合蛋白前体,补体成分4,基因2（C4b）。结论C4b是新发现的与AD相关的蛋白质,有可能是潜在的AD标志物,有助于更深刻地理解AD的发病机制。     

蛋白质组中蛋白质鉴定技术的研究近况

蛋白质组学的核心内容之一就是蛋白质的鉴定 ,基于双向凝胶电泳的图象分析技术可以对组织细胞蛋白质表达的量、表观分子量和等电点等特性进行初步的鉴定 ,但是对于蛋白质的结构和功能必须借助其它技术手段。目前逐渐形成了以生物质谱为核心的鉴定技术 ,蛋白质微测序和氨基酸组成分析在表达模式分析中也有应用。关于蛋白质组功能模式研究目前可用的方法有酵母双杂交、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、蛋白质工程中的定点突变技术等。这些技术对推动蛋白质组学的发展起了一定作用 ,但是单一技术通常不能确切的鉴定某一蛋白质 ,常需联合应用几种技术才能准确的鉴定蛋白质     

蛋白质芯片技术及应用

在高密度微孔板技术和DNA微阵列技术的基础上发展起来的蛋白质芯片技术,能够在蛋白质水平上进行基因高通量表达分析,从而成为蛋白质组学研究的有效方法。蛋白质芯片依靠手工、压印或喷墨的方法将探针蛋白点样在化学膜、凝胶、微孔板或玻片上形成阵列,经过与样品的杂交捕获靶蛋白,再用原子力显微镜、磷光成像仪、光密度仪或激光共聚焦扫描仪进行检测,获得靶蛋白表达的种类、数量及关联等信息。蛋白质芯片已经用于研究蛋白质表达谱构成及变化、蛋白质与生物分子(蛋白质、核酸、配体等)的相互作用、抗原体筛选、酶与底物相互作用。蛋白质芯片在医学临床诊断、疗效分析和药物筛选方面具有潜在的重要应用价值。     

蛋白质组学研究技术及其联合应用

蛋白质组学是研究细胞、组织和器官内所有蛋白质的组成及其动态变化的科学,是在蛋白质水平上定量的、动态的、整体的研究生物体。目前蛋白质组学技术分为样品制备、分离和鉴定3个方面,其新技术主要有激光捕捉显微解剖法、离心超滤法、双向凝胶电泳、同位素亲和标签技术、色谱技术以及质谱技术等。然而,任何一种蛋白质组学研究技术都有其缺陷。因此多种技术的联合应用能使蛋白质组研究更精确和完整,是蛋白质组学的发展趋势。     

人胃黏膜组织蛋白质组二维电泳图像的获得

目的初步建立并优化人类胃黏膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法刮取手术胃黏膜组织，对以固相pH梯度为第一向的双向凝胶电泳的关键因素与环节，如样品处理、上样量、电泳参数、凝胶浓度和SDS凝胶电泳染色方法等进行一系列的优化。以固相pH梯度——IPG胶条(pH=3—10)进行第一向等电聚焦，以SDS均一胶(13％)的垂直电泳为第二向。结果成功地得到了胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱。     

H22肝癌小鼠血清差异蛋白质的质谱鉴定

目的 分析正常小鼠和H22肝癌小鼠血清之间差异表达的蛋白并对部分差异蛋白进行鉴定分析,筛选可能与肝癌发生密切相关的蛋白质.方法 利用双向凝胶电泳技术（2-DE）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,分析正常组和肿瘤组筛选并鉴定部分差异表达的蛋白,再进行生物学分析.结果 通过2-DE图谱研究发现,与正常组相比,肿瘤组存在明显差异的蛋白质点.选择其中可能为关键功能蛋白的蛋白点进行质谱分析,获得肽指纹图谱（PMF）,运用Mascot软件查询NCBI数据库分析并鉴定得出其中2个蛋白：假尿苷合成酶和线粒体核糖体大亚基蛋白.结论 肝癌的发生机制与假尿苷合成酶和线粒体核糖体大亚基蛋白2个差异表达蛋白密切相关,其参与肝癌的发生发展.     

二维凝胶电泳的新技术及其应用

1975年 ,O'Farrell以及Klose等人发明了双向凝胶电泳 (two-dimensionalgelelectrophoresis,2 -DE) ,根据样品中蛋白质的两个重要理化特性 :等电点(is_oelectricpoints,PI)和分子量 (molecularweight,MW) ,将样品中的蛋白质进行分离。其原理是第一向基于蛋白质PI不同用等电聚焦 (isoelectricfocusing,IEF)分离 ,第二向则按MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳 (sodiumdodecylsulfate_polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分离 ,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。其后的25年中 ,2-DE经过了多方面的改进 …     

糖尿病大鼠胰腺差异表达蛋白质组分析

目的 运用蛋白质组学方法,对糖尿病大鼠胰腺蛋白质的表达进行分析。方法用链脲佐菌素（STZ）诱发建立1型糖尿病大鼠模型。用双向凝胶电泳（2D-PAGE）分离大鼠胰腺组织蛋白质,图像分析软件对比分析大鼠的双向电泳图谱,差异表达蛋白经胶内酶切,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析获得肽质量指纹图,使用Mascot方法进行检索鉴定。结果 对11个差异表达蛋白质进行分析鉴定,其中4个蛋白质得到有意义结果。结论 糖尿病大鼠胰腺蛋白质组的分析,有助于探索糖尿病的发病机制。     

胚胎大鼠神经干细胞双向凝胶电泳方法的建立

背景:神经干细胞是当今研究热点,双向电泳是蛋白质组学研究的技术基础,有必要建立稳定的神经干细胞蛋白质组双向凝胶电泳技术体系。目的:通过对神经干细胞双向凝胶电泳几个关键步骤的分析,建立稳定、重复性好的神经干细胞双向凝胶电泳的分离方法。方法:采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎大鼠神经干细胞并进行鉴定。提取样品蛋白并裂解,被动水化,采用不同IEF 参数,使用 PDQuest8.0 软件对图谱进行分析和比较。观察不同等点聚焦参数下双向电泳图谱质量,蛋白质点的数目及重复性。结果与结论:不同 IEF 参数条件下的双向电泳图谱的质量有所不同,增加低电压的除盐步骤有助于去除电泳胶图上的横纹。在 80 000 Vh 聚焦总能量下,获得较理想的电泳图。通过选用适当的 IEF 参数,建立了适当的神经干细胞双向凝胶电泳方法。     

bFGF诱导的心肌微血管内皮细胞蛋白质组变化

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对培养的心肌微血管内皮细胞(MMEC)蛋白质表达变化的影响。方法:将培养的MMEC随机分为二组(n均=3):(1)bFGF诱导组(bFGF组):向培养瓶内加入终浓度10ng/ml的bFGF,置细胞培养箱内常氧培养24h。(2)对照组:常规37℃培养箱孵育。二组均提取细胞总蛋白质双向凝胶电泳后选取8个差异表达蛋白点进行胶内酶切、肽质量指纹图谱分析。结果:双向凝胶电泳可分离出约500±10个蛋白质。与对照组相比,bFGF组MMEC特异表达8种蛋白,上调1种蛋白表达,下调3种蛋白表达(bFGF组和对照组蛋白点的Volume值相差≥2.0倍)。结论:bFGF能诱导MMEC蛋白质差异表达。     

B6-Co突变系小鼠混浊角膜组织蛋白的二维凝胶电泳分析

背景：从蛋白质组学水平研究B6-Co突变系小鼠浑浊角膜与正常B6小鼠角膜组织的异同,有利于阐释人类角膜混浊的发生机制,开辟从表型驱动研究基因功能的新途径。 目的：应用二维凝胶电泳分析技术比较分析B6和B6-Co小鼠的角膜蛋白质组学差异。 方法：分别提取B6与B6-Co突变系小鼠角膜组织蛋白,将所获得的蛋白质样品进行二维凝胶电泳和凝胶染色,分析电泳图谱,比较正常角膜组织与混浊角膜组织的蛋白质异同。 结果与结论：实验成功建立了对小鼠两种角膜组织蛋白的提取及二维凝胶电泳的基本方法和条件,二维凝胶电泳图谱清晰,通过比较分析发现B6-Co突变系小鼠混浊角膜蛋白质组中有13个蛋白质点显著下调,6个表达显著上调。B6小鼠和B6-Co突变系小鼠角膜蛋白质组有显著差异表达,提示由于基因的突变导致了相关信号通路的基因表达上调、下调或沉默。     

肝细胞癌患者血清蛋白质组成分的双向凝胶电泳-飞行时间质谱分析

目的　分析肝细胞癌患者与正常人血清双向凝胶电泳的差异蛋白质 ,寻找肝癌早期血清学诊断的可能指标。方法　固相 pH梯度双向凝胶电泳分离肝细胞癌患者及正常人血清总蛋白。银染显色 ,PDQuest 2DE软件分析 ,对差异蛋白质点用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PepIdent软件查询SWISS PROT数据库。 结果　获得了重复性较好的双向电泳银染图谱。图像分析检测 3块胶平均匹配的点数占平均蛋白点数的匹配率是 70 2 %。等电聚焦方向的平均偏差为 (1 0 2± 0 2 2 )mm ,十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)方向的平均偏差为 (0 97± 0 14 )mm。将 2 3个差异点进行胶内原位酶解 质谱指纹图分析 ,获得 15张肽质指纹图 ,查询数据库进行了初步鉴定。结论　固相 pH梯度双向凝胶电泳分离人血清总蛋白获得重复性较好的结果 ,但仍需进一步探索如何去除高丰度已知蛋白及脂类等物质的方法 ,以便得到分辨率更高的双向电泳银染图谱。MALDI TOF MS肽质指纹图分析鉴定的结果为人肝细胞癌血清学诊断指标的筛选提供了依据     

应用蛋白质组学分析结直肠癌促泌素和糖调节蛋白78蛋白变化及其意义

目的分析结直肠癌、配对正常黏膜组织差异表达蛋白质,寻找与结直肠癌发生、发展相关的分子标记物。方法固相pH梯度双向凝胶电泳分离结直肠癌患者配对癌及正常黏膜组织的总蛋白,液相色谱串联质谱鉴定差异表达蛋白质点。半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫组织化学（EnVision法）方法检测促泌素（SCGN）及糖调节蛋白78（GRP78）两个差异表达蛋白质及组织定位,并检测54例神经内分泌肿瘤SCGN的表达。结果比较结直肠癌、配对正常黏膜组织蛋白质表达图谱,共获得5倍以上差异蛋白质点35个,癌组织中表达上调15个、下调20个。质谱分析鉴定14个蛋白质。RT-PCR及Western blot证实结直肠癌组织SCGN低表达,免疫组织化学染色发现正常结直肠黏膜神经内分泌细胞及98％（53／54）的神经内分泌肿瘤SCGN阳性。GRP78蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于正常黏膜组织,但在mRNA水平上癌组织和正常组织之间差异无统计学意义。结论双向凝胶电泳结合质谱分析是筛选肿瘤异常表达蛋白质的有效手段,所获得的35个差异表达候选蛋白质可能与结直肠癌的发生、发展有关。SCGN是一个候选神经内分泌标记物,GRP78蛋白表达增高可能涉及翻译后修饰。     

老年大鼠心肌线粒体的比较蛋白质组学研究

目的:筛查心肌线粒体中与衰老相关的蛋白质。 方法：分离成年组（10周）和老年组（12月）雄性SD大鼠心肌线粒体，抽提心肌线粒体蛋白质行双向凝胶电泳，应用MALDI-TOF-MS和数据库搜索鉴定图像分析出的差异蛋白点，同时进行了心肌组织ATP含量的检测。 结果:图像分析示84个心肌线粒体蛋白表达发生改变，质谱鉴定了15个差异点。老年组肌酸激酶、硫氧还原蛋白过氧化物酶2、Tu翻译延长因子、异柠檬酸脱氢酶4个蛋白表达上调，琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乌头酸水合酶、NADH脱氢酶、ATP合酶H+转运装置、ATP合酶β链、热休克蛋白60、葡萄糖调节蛋白78、prohibitin、乙醛脱氢酶2、电压依赖型阴离子通道11个蛋白表达下调。老年组心肌组织ATP含量下降(P<0.01)。 结论:通过具有高度分辨率和高度重复性的双向凝胶电泳图谱鉴定了SD大鼠心肌线粒体中在老年组差异表达的蛋白质，这些差异蛋白为深入理解衰老的分子机制提供了有益的线索，差异蛋白的功能留待以后进一步研究。     

胃癌不同转移能力细胞系的2-DE图谱及差异分析

目的建立胃癌低转移能力细胞系RF1和高转移能力细胞系RF48的2DE图谱,并分离胃癌转移相关蛋白质。方法利用固相pH梯度技术(immobilizedpHgradient,IPG)双向凝胶电泳(twodimensioanlpolyacrylamidegelelectrophoresis,2DE)建立胃癌低转移能力细胞系RF1和高转移能力细胞系RF48二维电泳图谱;采用图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质,分离胃癌转移相关蛋白质。再利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)及数据库查询,对部分差异表达蛋白质点进行鉴定。结果建立胃癌低转移能力细胞系RF1和胃癌高转移能力细胞系RF48双向凝胶电泳图谱;三块凝胶的平均蛋白质点数分别为960±92和978±83,平均匹配的点数分别为780±69和769±53,匹配率达87%和86.3%;对25个差异蛋白质点进行肽质指纹图分析,鉴定出与瘤基因、细胞周期调控和信号转导有关的蛋白质。结论建立分辨率高且重复性较好的人胃癌低转移能力细胞系RF1和胃癌高转移能力细胞系RF48的双向凝胶电泳图谱,可以识别和鉴定出一些与胃癌转移相关的差异表达蛋白质。     

人晶状体上皮细胞蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定

目的： 建立人晶状体上皮细胞蛋白质组研究体系，探讨双向电泳和质谱鉴定技术在人晶状体上皮细胞蛋白质组研究中的作用。 方法: 体外培养人晶状体上皮细胞株，用两种不同方法提取总蛋白，进行固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳，凝胶通过GS-800扫描仪（Bio-Rad）获取图像并使用PDQuest专业图像分析软件分析。在此基础之上，胰酶消化蛋白质斑点并进行质谱分析。 结果: 获得了重复性较好的人晶状体上皮细胞蛋白质组电泳图谱。晶状体蛋白质斑点在等电点pH值为4-7、相对分子质量为17-72 kD之间均有分布。其中高丰度蛋白点主要分布于分子量19-50 kD、PI 5-7范围内。2个蛋白点通过质谱分析和数据库的检索得到了初步的鉴定。 结论: 建立起了一个稳定的分析人晶状体上皮细胞蛋白质组学实验体系；为进一步研究人类晶状体在生理状态及白内障等病理条件下的改变提供了蛋白质组学的研究方法和途径。