转Weel基因靶细胞抗CTL介导的细胞毒效应

目的：研究Weel转基因细胞抗CTL介导的细胞毒效应及抗穿孔素抗体对抗细胞毒效应的影响。方法：体外混合NTT及淋巴细胞培养获得CTL，并测定淋巴细胞增殖指数(MTT法)；采用脂质体将重组体Weel Hu／GFP导人哺乳动物细胞NIT；以转染重组体前后的NIT为靶细胞，检测CTL介导的胞毒效应(LDH法)，同时测定抗穿孔素抗体对此效应的影响。结果：混合细胞培养可诱导CTL的增殖；转染Weel基因及加入抗穿孔素抗体NIT组发生的细胞溶解的数量最少。结论：转Weel基因靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞毒作用，穿孔素抗体可协同增强此抗胞毒作用。     

Wee1基因修饰细胞抗CTL诱导的凋亡效应

目的　研究Wee1转基因细胞抗CTL介导的凋亡效应及抗穿孔素抗体的对此抗凋亡效应的影响。方法　采用DNA转染技术将重组体Wee1Hu GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞 ) ;以转染重组体前、后的NIT为靶细胞 ,采用ELISA凋亡试剂盒检测CTL介导的凋亡效应。结果　转染Wee1及加入抗穿孔素抗体的NIT组发生凋亡的细胞数最少。结论　Wee1基因转染靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞凋亡 ,而穿孔素抗体可协同增强此抗凋亡效应。     

转Wee1基因靶细胞抗CTL介导的细胞毒效应

目的 :研究Wee1转基因细胞抗CTL介导的细胞毒效应及抗穿孔素抗体对抗细胞毒效应的影响。方法 :体外混合NIT及淋巴细胞培养获得CTL ,并测定淋巴细胞增殖指数 (MTT法 ) ;采用脂质体将重组体Wee1Hu GFP导入哺乳动物细胞NIT ;以转染重组体前后的NIT为靶细胞 ,检测CTL介导的胞毒效应 (LDH法 ) ,同时测定抗穿孔素抗体对此效应的影响。结果 :混合细胞培养可诱导CTL的增殖 ;转染Wee1基因及加入抗穿孔素抗体NIT组发生的细胞溶解的数量最少。结论 :转Wee1基因靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞毒作用 ,穿孔素抗体可协同增强此抗胞毒作用。     

FADDdel-GFP真核表达载体的构建及其抗细胞毒效应初步观察

目的构建融合蛋白FADDdel-GFP真核表达载体pFADDdel-GFP，用该融合基因转染小鼠胰岛瘤细胞(NIT)，从而抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导，以探讨IDDM的发病机制及防治措施。方法采用基因重组技术将FADDdel定向连接于真核表达载体pEGFP-N1，用脂质体将重组子pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT并检测其表达，采用FACS和MTT法检测特异性T细胞对转染重组子NIT引起的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NIT可见绿色荧光蛋白表达；pFADDdel-GFP转染的NIT对特异性T细胞介导的细胞毒有明显抵抗。结论成功构建pFADDdel-GFP融合基因并获稳定表达；pFADDdel-GFP转染NIT可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的胰岛细胞凋亡的影响

目的研究融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的细胞凋亡信号的生物学效应,以探讨通过基因修饰靶细胞对1型糖尿病的影响。方法用脂质体将融合基因pFADDdel-GFP导入胰岛细胞株NIT,通过细胞RT-PCR和荧光显微镜检测其表达,采用FACS检测抗-Fas抗体诱导的胰岛细胞株的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NITf-g细胞可见绿色荧光蛋白表达;NITf-g细胞对抗-Fas诱导的细胞损伤率为10.16%,细胞内的Caspase-3的活性为12.33%,均明显低于对照组（P〈0.05）。结论成功建立了稳定表达FADDdel-GFP的胰岛细胞株;FADDdel-GFP可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

Wee1-GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究

目的: 研究Wee1-GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响.方法: 采用脂质体将融合基因Wee1-GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT-1)并检测其表达.以转染pWee1-GFP和空载体的NIT-1为靶细胞, 采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应.结果: Western blot检出Wee1-GFP融合蛋白的表达.转染Wee1-GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少.结论: Wee1-GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力.     

融合基因FADDdel-GFP修饰在胰岛细胞自杀效应中的作用

目的 研究FADDdel-GFP在Fas/FasL介导的胰岛细胞自杀效应中的作用.方法 采用DNA转染技术将重组体pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞);采用FACS检测细胞因子诱导后NIT细胞的Fas和FasL表达情况及细胞自杀效应;采用active caspase3检测试剂盒检测细胞因子作用前后NIT细胞的caspase-3活性变化.结果 NIT细胞表面无Fas和FasL表达,细胞因子可促其表达增加;细胞因子作用后,FADDdel-GFP修饰的NIT细胞的细胞损伤百分率和细胞内caspase3活性明显低于对照组.结论 FADDdel-GFP修饰的NIT细胞具有一定的抵抗Fas/FasL途径介导细胞自杀效应的能力.     

HBV S基因修饰树突状细胞疫苗诱导特异性CTL反应的探讨

目的分析腺病毒载体介导HBVS基因修饰树突状细胞（DCs）能否诱导抗HBV特异性CTL反应。方法制备携带HBVS基因的重组腺病毒，分别转染外周血诱导培养的DCs，观察腺病毒转染DCs效率和DCs中HBV抗原的表达；混合淋巴细胞反应测定HBV抗原基因修饰DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力；乳酸脱氢酶释放法检测特异性CTL细胞对HepG2 22．1．5靶细胞的杀伤能力。结果腺病毒载体能够高效介导HBVS基因在DCs中表达，且DC细胞形态完整；HBVS基因修饰DCs具有刺激同种异体T细胞增殖能力，同时能诱导抗HBV特异性CTL反应。结论HBVS基因修饰DCs疫苗具有增强抗HBV特异性CTL效应的能力，可能发展为一种新型抗病毒疫苗。     

穿孔素介导的细胞凋亡机制在抗流感病毒感染免疫防御中作用的研究

目的：穿孔素介导的细胞凋亡机制在流感病毒初次感染中作用的研究。方法：用流感病毒A／PR／8／34经鼻感染穿孔素基因敲除鼠和同源对照C57BL／6小鼠，采用PFU方法测定肺内流感病毒增殖状况；免疫组织化学染色方法观察小鼠病毒感染后感染细胞的凋亡情况；利用乳酸脱氢酶释放法检测感染鼠脾淋巴细胞NK活性及CTL杀伤活性。结果：穿孔素基因缺乏导致流感病毒在小鼠肺内大量增殖；小鼠清除感染病毒所需时间延长；病毒感染细胞发生凋亡的时间亦因穿孔素的缺乏而延迟；感染小鼠脾淋巴细胞NK活性及CTL杀伤活性均显著降低。结论：穿孔素依赖的细胞介导的细胞毒效应在控制流感病毒初次感染，快速清除感染病毒方面起重要作用。     

颗粒酶A介导的凋亡机制研究现状

目的:CTL细胞杀伤靶细胞有两个重要方式:即分泌型和非分泌型杀伤。前者指的是如穿孔素/(颗)粒酶类介质使靶细胞裂解,后者主要指通过FAS-FASL结合等一类途径诱导凋亡。(颗)粒酶A是(颗)粒酶家族中含量较多、作用方式较独特、且相当重要的一种物质。穿孔素/(颗)粒酶A/SET复合物介导的凋亡途径是一条重要的途径,它通过引起单股DNA链缺刻和DNA修复障碍导致细胞凋亡。其在杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞及异体移植物细胞有重要意义,近年来对穿孔素/(颗)粒酶A/SET复合物介导的细胞凋亡途径研究比较多,本文拟在这方面作一些综述。     

CTL定向释放的RANTES在肿瘤靶细胞的重新分布

目的研究受肿瘤靶细胞激活的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）释放趋化因子RANTES（reduced upon activation，normal T cell expressed and secreted）的特征。方法以酪氨酸酶特异性CTL为效应细胞，以特异性表达HIL—A2-酪氨酸酶的黑色素瘤细胞为靶细胞，应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪技术，分析RANTES在效、靶细胞之间的动态分布；利用三重免疫荧光染色，观察受靶细胞激活的CTL定向释放的RANTES与穿孔素的共定位。结果CTL识别肿瘤靶细胞时，RANTES从活化的CTL内释放，且重新分布于和CTL接触的靶细胞表面，而非靶细胞表面没有RAN—TES的分布。RANTES和穿孔素共同参与形成免疫突触（immune synapse）。结论CTL受肿瘤靶细胞激活时，定向释放的RANTES重新分布于肿瘤靶细胞表面。     

TRAIL系统与细胞凋亡

TRAIL及TRAIL R是新发现的细胞凋亡系统。Caspase 8在TRAIL系统介导细胞凋亡信号中起关键作用。TRAIL有选择性细胞毒性 ,可介导IFN的抗肿瘤、抗病毒作用 ,可能在T细胞活化诱导凋亡及CTL介导的靶细胞凋亡过程中起重要作用     

CFSE和AnnexinV双标记技术检测细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效应

目的 利用CFSE和AnnexinV对靶细胞进行染色,建立一种通过流式细胞仪技术检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤效应的新方法.方法 应用磁珠分 OT-Ⅰ T细胞受体(TCR)转基因小鼠CD8+CTL细胞和脾脏树突状细胞(sDC),将2种细胞和鸡卵蛋白(OVA)抗原肽共培养65 h后分析其细胞分裂增殖、IFN-γ和IL-4细胞内因子及穿孔素、颗粒酶等效应分子的表达特性,收获具备杀伤效应的CD8+CTL细胞.利用预先激活的小鼠CD8+CTL细胞作为效应细胞,CFSE标记的同系小鼠脾细胞作为靶细胞,体内体外2种条件下利用AnnexinV染色靶细胞检测特异性CTL杀伤效应,并与CFSEhigh和CFSElow标记靶细胞检测体内CTL杀伤效应的经典方法进行比较.结果 OT-Ⅰ初始CD8+CTL细胞体外活化培养后有4个分裂峰,54.1%的CTL细胞表达IFN-γ,0.78%的细胞表达IL-4,穿孔素、颗粒酶2种CTL效应分子均为阳性表达,CD8+CTL细胞已经具备CTL杀伤活性.体外实验结果显示OVA+靶细胞在共培养条件下,AnnexinV阳性细胞比例明显高于分离培养条件下[(62.4±3.5)%比(28.3±2.2)%,P＜0.01],OVA-的AnnexinV阳性靶细胞比例在不同培养条件下差异无统计学意义[(20.3±4.8)%比(17.3±2.9)%,P＞0.05].共培养条件下OVA+靶细胞其AnnexinV阳性细胞比例也明显高于OVA-靶细胞(P＜0.01),在分离培养条件下差异则无统计学意义(P＞0.05).活化的CD8+CTL细胞所介导的杀伤效应具有抗原依赖性和部分的细胞接触依赖性.体内CTL实验中,利用CFSE和AnnexinV双标记的方法检测出靶细胞的杀伤率高于未孵育OVA抗原肽的对照组靶细胞[(52.63±8.12)%比(13.84±4.37)%,P＜0.01].而同等条件下利用CFSEhigh和CFSElow双标记的方法检出靶细胞杀伤率为41%.结论 CFSE和AnnexinV双标记靶细胞的方法检测CTL杀伤效应与单纯的使用CFSEhigh和CFSElow标记靶细胞方法有很好的可比性,该策略为利用流式细胞仪技术检测细胞杀伤功能的方法学提供了新的选择.     

兔抗重组穿孔素抗体的制备及特性鉴定

目的:制备兔抗重组穿孔素的抗体,检测其免疫反应性,并用于穿孔素的体外功能定位分析。方法:以纯化的全长穿孔素融合蛋白DsbAfulllength免疫新西兰大白兔制备抗血清,用免疫双扩法检测抗血清的效价,Westernblot检测抗血清与5个穿孔素侯选活性区域重组融合蛋白的免疫反应性。将活性重组穿孔素体外作用HIV1SF33感染的MT4细胞后,用免疫组化染色法显示穿孔素作用的部位。结果:用免疫双扩法检测表明,兔抗穿孔素融合蛋白抗血清的效价为1∶32;Westernblot显示,抗血清可与穿孔素各重组融合蛋白发生特异性结合;免疫组化显示,穿孔素作用的部位位于靶细胞的胞质和胞膜。结论:制备的兔抗重组穿孔素融合蛋白的抗体具有较好的免疫反应性和特异性,为穿孔素的深入研究提供了有力的工具。     

穿孔素研究进展

穿孔素是细胞毒性T细胞（CTL）和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。近来的研究表明，穿孔素不仅是重要的效应分子，而且是重要的免疫调节分子，在抗肿瘤免疫、抗病毒免疫和自身免疫中起着重要的调节作用。本文着重就穿孔素在免疫调节中的研究进展做一简要综述。     

024 穿孔素研究进展

穿孔素是细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。近来的研究表明，穿孔素不仅是重要的效应分子，而且是重要的免疫调节分子，在抗肿瘤免疫、抗病毒免疫和自身免疫中起着重要的调节作用。本文着重就穿孔素在免疫调节中的研究进展做一简要综述。     

Fas Ligand转染人肝癌细胞株HepG2细胞后的生物学效应

目的：将FasL-peDNA3．1 hisB转染至人肝癌细胞株HepG2并检测其生物学效应。方法：转染采用脂质体转染方法，HepG2细胞FasL的表达采用免疫组化检测，培养液上清sFasL的检测采用EIA，细胞凋亡采用Annexin V／P1双染后双变量流式细胞仪检测及荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察。结果：转染后HepG2细胞FasL表达呈阳性，培养液上清检测出微量sFasL，转染后HepG2细胞与HepG2．2．15共同培养后，细胞凋亡率为36．30％，未转染FasL的对照组细胞凋亡率11．53％。结论：将FasLcDNA转染入肝癌细胞系HepG2，可使肝癌细胞发生细胞毒性T细胞（CTL）非依赖Fas-FasL介导的细胞凋亡。     

用免疫金标记技术对LAK细胞和CTL细胞中穿孔素和丝氨酸酯酶进行亚细胞水平定位

已知CTL,NK 和LAK 细胞胞浆颗粒中含有包括穿孔素和丝氨酸酯酶家族在内的多种介质,其中穿孔素可在胞浆膜上形成管状通道而溶解靶细胞。目前对这两种介质的确切分布尚不清楚。现采用胶体金标记技术对LAK 和CTL 细胞颗粒中这两种介质进行了定位研究。LAK 细胞由C_(57)BL/6小鼠脾细胞制备。将脾细胞过尼龙毛柱收获不粘附细胞,用重组人IL-2刺激2天,去除不粘附塑料之细胞后再培养2天收获LAK 细胞,所得LAK 细     

穿孔素研究进展

穿孔素是细胞毒性T细胞 (CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。近来的研究表明 ,穿孔素不仅是重要的效应分子 ,而且是重要的免疫调节分子 ,在抗肿瘤免疫、抗病毒免疫和自身免疫中起着重要的调节作用。本文着重就穿孔素在免疫调节中的研究进展做一简要综述。     

抗人喉癌/抗CD3双功能抗体的制备及对Hep-2细胞株的杀伤作用

目的：研究制备抗人喉癌／抗CD3双功能抗体，探讨喉癌主动免疫治疗。方法：以化学方法将人喉癌及抗CD3单克隆抗体交联为双功能抗体，进行介导对肿瘤细胞的杀伤作用。结果：该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗CD3的介导作用，并随着效靶比的提高而升高。结论：采用化学交联法制备的抗人喉癌／CD3双功能抗体具有潜在的临床应用价值。