siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。     

SIRT3过表达抑制肝癌细胞的迁移与侵袭

目的探讨沉默信息调节因子(SIRT)3对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响。方法用对照pcDNA3.1质粒转染Huh-7细胞(对照组),用SIRT3质粒转染Huh-7细胞(实验组)。用实时荧光定量PCR检测两组SIRT3mRNA表达水平,用蛋白质印迹法检测两组SIRT3蛋白表达水平。SIRT3过表达成功后,用细胞划痕实验和细胞侵袭实验检测SIRT3过表达Huh-7细胞的迁移和侵袭能力。结果与对照组相比,实验组SIRT3mRNA、蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。细胞划痕实验结果显示,划痕48h时,实验组两侧细胞间的距离明显宽于对照组,迁移距离较短。细胞侵袭实验结果显示,两组细胞接种于上室10h后收集,显微镜下计数,对照组每个视野为(45±5)个细胞,实验组每个视野为(25±2)个细胞,差异有统计学意义(P0.05)。结论 SIRT3过表达抑制肝癌细胞的迁移与侵袭,其有望作为肝癌治疗新的分子生物学靶点。     

MiR-132靶向YAP抑制肝癌Huh7细胞的生长

目的研究miR-132靶向YAP后对肝癌Huh7细胞生长的抑制,为临床治疗肝癌的方法提供新的理论依据。方法实验分为三组:未转染miR-132的Huh7细胞组(control组),阴性对照组(miR NC组)以及转染miR-132的Huh7细胞组(miR-132组),通过RT-PCR检测YAP mRNA表达情况;通过流式细胞仪检测细胞凋亡改变;通过Edu检测细胞增殖能力;通过Transwell法检测细胞侵袭能力。结果 RT-PCR检测YAP mRNA发现miR-132可明显抑制YAP基因在肝癌细胞株Huh7中的表达,control组、miR NC组和miR-132组YAP mRNA的相对表达量为1.000 0±0.024 1、0.942 6±0.024 8和0.257 3±0.045 8(P<0.05);流式细胞仪检测发现转染miR-132后能明显促进肝癌Huh7细胞的凋亡,control组、miR NC组和miR-132组Huh7细胞总凋亡为4.03±0.35、4.53±0.26和13.62±0.49(P<0.05);EdU检测发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞增殖能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为(65.12±1.93)%、(64.02±0.87)%和(42.00±1.26)%(P<0.05);traswell检测结果发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞侵袭能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为3.35±0.13、0.72±0.06和0.48±0.03(P<0.05)。结论 miR-132具有抑制肝癌细胞生长的作用,并有可能通过靶向YAP而下调其表达起作用。     

慢病毒介导的IGF-1R基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响。方法设计并筛选高效特异性胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,观察其转染沉默IGF-1R基因的肝癌细胞株Huh7细胞增殖、迁移以及侵袭能力,进一步观察其对PI3K/Akt及Bax/Bcl-2通路的影响。结果采用倒置相差荧光显微镜观察转染效果,镜下可见较多细胞特异性表达GFP绿色荧光,转染率超过80%。scrambled阴性对照组以及空白对照组IGF-1R mRNA及蛋白的相对表达量显著高于LV-IGF-1R-RNAi转染组(P0.01)。成功转染后,培养细胞72 h、96 h,LV-IGF-1R-RNAi转染组增值率显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05或P0.01)。侵袭实验和迁移实验均证实细胞明显受到抑制(P0.01)。蛋白免疫印迹法显示,LV-IGF-1R-RNAi转染组p-PI3K、p-Akt及Bcl-2相对表达量显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05);而Bax显著高于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05)。结论RNAi技术沉默IGF-1R基因表达能显著抑制肝癌细胞株Huh7细胞的增殖、侵袭作用,而这一作用可能与抑制PI3K/Akt通路蛋白磷酸化及调节Bax/Bcl-2通路蛋白表达有关。     

siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达水平及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响

目的分析胰腺癌BXPC-3细胞中原癌基因人表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)基因siRNA沉默对环氧合酶-2(COX-2)表达水平及其对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法通过Western blot法与实时荧光定量PCR法对正常胰腺细胞株和胰腺癌BXPC-3细胞中的COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达进行检测。建立Her-2/neu基因siRNA慢病毒表达载体并对BXPC-3细胞进行转染,其中转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体为观察组,转染NC-GFP-LV为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。分别采用CCK-8法、流式细胞分析仪和细胞实验技术(Transwell实验)分析Her-2/neu基因siRNA沉默对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。结果 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中的表达水平明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞的表达(P0.01)。观察组COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达水平明显下调,较阴性对照组与空白对照组表达水平均明显降低(P0.01),而阴性对照组与空白对照组表达水平的比较,并无显著差异(P0.05)。Her-2/neu基因siRNA沉默可明显减弱细胞增殖和侵袭力,增加细胞凋亡率。结论 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中均呈现高表达,且Her-2/neu基因siRNA沉默可明显阻滞细胞增殖及侵袭,导致细胞凋亡。     

Wnt/β-catenin通路及uPA在子宫内膜癌中的作用机制研究

目的探究Wingless/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路及尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)在子宫内膜癌(EC)中的作用机制。方法将人EC细胞KLE分为5组,即对照组、阴性对照组、Wnt-1组、si-uPA组和Wnt-1+si-uPA组,其中Wnt-1组通过转染Wnt-1 pcDNA 3.1质粒上调Wnt-1的水平;si-uPA组通过转染si-uPA质粒敲低uPA的水平。Wnt-1+si-uPA组共同转染Wnt-1 pcDNA 3.1以及si-uPA;空质粒被用于阴性对照组。检测转染后各组细胞Wnt-1、β-catenin、uPA m RNA和蛋白表达水平,以及细胞活力、细胞迁移和侵袭能力。结果 Wnt-1组的Wnt-1、β-catenin、uPA水平均显著高于对照组和阴性对照组,并且Wnt-1的水平会影响uPA mRNA和蛋白的表达。si-uPA组的Wnt-1、β-catenin表达水平变化不显著,而uPA mRNA和蛋白的水平显著降低。Wnt-1+si-uPA组的Wnt-1和β-catenin也无显著变化且uPA mRNA和蛋白水平显著低于Wnt-1组。培养48 h后,Wnt-1组细胞活力、细胞迁移率和侵袭率升高而si-uPA组细胞活力、细胞迁移率和侵袭率降低。并且Wnt-1+si-uPA组细胞活力、细胞迁移率和侵袭率显著低于Wnt-1组。Wnt-1组MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA水平升高而si-uPA组降低,并且Wnt-1+si-uPA组MMP2、MMP9、N-cadherin mRNA水平显著低于Wnt-1组。结论在EC细胞中,Wnt/β-catenin的过表达会通过促进uPA的表达促进EC的迁移和侵袭。     

小片段干扰RNA抑制人肝癌细胞株中YAP基因表达的研究

目的:研究用小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞株中YAP(yes-associated protein)表达后肝癌细胞株对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性变化。方法:设计YAP基因的siRNA序列,用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA转染至4株肝癌细胞株PLC/PRF/5、Huh-7、MHCC97H、MHCC97L中,在荧光显微镜下观察并采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测肝癌细胞株中YAP的表达。将细胞以不同浓度的ADM处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thialzolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞的存活率。结果:成功构建针对YAP的siRNA表达载体。Western blotting结果显示,肝癌细胞株经特异性siRNA转染后,YAP蛋白的表达受到抑制,表明RNA干扰(RNA interference,RNAi)能特异、有效地抑制肝癌细胞株中YAP的表达。MTT结果显示,转染YAP siRNA后肝癌细胞株的存活率受到明显抑制。结论:siRNA抑制肝癌细胞株中YAP的表达可增强肝癌细胞株对ADM的敏感性。     

Mfn-2沉默对肝癌细胞侵袭及PITPNM3表达的影响

目的探究Mfn-2沉默对肝癌细胞侵袭的影响及其潜在的分子机制。方法用Mfn-2-siRNA和siRNA转染SMMC-7721细胞,为Mfn-2-siRNA组和siRNA组,以未经转染的细胞作为对照组。转染48 h后,采用荧光倒置显微镜检测转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SMMC-7721细胞中Mfn-2的表达情况,Transwell小室检测SMMC-7721细胞侵袭能力,免疫组化和Western blot检测SMMC-7721细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和磷脂酰肌醇转移蛋白3(PITPNM3)蛋白表达情况。结果荧光倒置显微镜检测结果显示,转染效率约85%;siRNA组SMMC-7721细胞中Mfn-2 mRNA的表达水平与对照组相比无显著差异(P0.05),Mfn-2-siRNA组SMMC-7721细胞中Mfn-2 mRNA的表达水平显著低于对照组(P0.05);siRNA组SMMC-7721细胞侵袭能力、以及MMP-2和PITPNM3的表达水平与对照组相比无显著差异(P0.05),Mfn-2-siRNA组SMMC-7721细胞侵袭能力、以及MMP-2和PITPNM3的表达水平显著高于对照组(P0.05)。结论 Mfn-2沉默能够增强肝癌细胞SMMC-7721的侵袭能力,推测这一作用是通过上调MMP-2和PITPNM3的表达水平实现的,上述结果为肝癌的治疗和靶向药物的开发提供了一定理论基础。     

SiRNA沉默FUT6基因对HepG2细胞侵袭和迁移能力的影响

目的：通过siRNA干扰技术研究FUT6基因沉默对HepG2细胞侵袭和迁移能力的影响。方法：靶向FUT6的siRNA转染肝癌细胞株HepG2后,通过western blot检测FUT6蛋白的表达,通过流式细胞术检测肝癌细胞表面抗原唾液酸路易斯糖（Sialyl Lewis X, sLeX）表达情况。Transwell小室方法进行细胞迁移和侵袭实验检测肝癌细胞株HepG2转移和侵袭能力的变化。结果：实验分为3组,分别命名为control（空白对照组）,mock（阴性对照scrambled-siRNA）和siRNA-FUT6（实验组）。实验组FUT6蛋白及sLeX抗原较空白对照组明显降低,实验组细胞的迁移能力及侵袭能力下降。结论：siRNA靶向沉默FUT6减少了FUT6蛋白的表达,减少了肿瘤相关抗原sLeX的表达,削弱HepG2细胞在体外的迁移和侵袭能力,FUT6可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

RNAi沉默ROCK-1基因抑制人视网膜母细胞瘤细胞株Y79的增殖、侵袭和转移

目的探讨利用RNA干扰技术(RNAi)沉默人视网膜母细胞瘤Y79细胞株ROCK-1基因对细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法实验设空白对照组、阴性脂质体组、实验组。转染后48 h,采用半定量RT-PCR检测ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA的相对表达变化,采用Western blot检测ROCK-1、MMP9和CXCR4蛋白的表达变化。采用MTT法在转染后24 h、48 h、72 h分别检测细胞的生长情况。采用Transwell小室检测转染后细胞的侵袭和迁移能力。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组细胞ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下调;细胞生长活力显著下降、凋亡比率显著增加;基因沉默显著抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,差异均具有统计学意义。结论应用ROCK-1-siRNA转染人视网膜母细胞瘤Y79细胞株,可有效抑制细胞的增殖、侵袭和迁移。小干扰RNA治疗有望成为人视网膜母细胞瘤靶向治疗的新手段。     

过表达FOXB2对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨叉头框蛋白B2（FOXB2）对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用定量PCR检测正常肝细胞LO2细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞FOXB2 mRNA的表达,构建过表达FOXB2的细胞模型,逆转录实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测过表达效率,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测FOXB2对Huh7细胞增殖能力的影响;平板克隆实验检测FOXB2对Huh7细胞克隆形成能力的影响;Transwell实验检测FOXB2对Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 FOXB2在肝癌细胞系Huh7和Hep3B细胞中的表达水平低于正常肝细胞LO2（P<0.001）;过表达FOXB2抑制了Huh7细胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2过表达肝癌细胞的迁移（P<0.001）和侵袭（P=0.002）能力低于Vector对照细胞。结论 FOXB2在肝癌细胞中低表达,FOXB2过表达抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

吉非替尼和NS398对前列腺癌PC-3M细胞增殖和侵袭力影响的研究

目的应用表皮生长因子受体(EGFR)特异性阻断剂吉非替尼(Gefitinib)和环氧化酶2(COX-2)特异性阻断剂NS398单独或联合作用于前列腺癌PC-3M细胞,观察对细胞增殖和侵袭能力的影响及可能机制研究。方法采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)和Transwell检测Gefitinib和NS398应用对细胞增殖和侵袭能力的影响,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测药物应用前后基质金属蛋白酶9(MMP-9)、表皮生长因子(VEGF)基因和蛋白表达水平的变化。结果 MTT结果显示Gefitinib或NS398都可抑制PC-3M细胞增殖(P<0.05),两者联合应用作用更明显(P<0.01),Transwell结果表明两种阻断剂都能在一定程度上抑制细胞侵袭能力(P<0.05),联合应用后抑制作用更显著(P<0.01),qRT-PCR和Western blot结果提示,联合应用Gefitinib和NS398对MMP-9、VEGF的抑制作用明显高于单独应用(P<0.01)。结论 Gefitinib和NS398联合应用可显著抑制PC-3M增殖和侵袭转移,可能与抑制VEGF和MMP-9表达有关。     

羧肽酶A4活化STAT3促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探究肿瘤相关基因羧肽酶A4(CPA4)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其相关分子机制。方法慢病毒载体构建MHCC97L-CPA4过表达细胞系和MHCC97H-shCPA4敲减细胞系,分别以MHCC97L-vector和MHCC97H-shNC细胞系作为对照。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blot检测各组细胞中CPA4 mRNA和蛋白质的表达;CCK8试验和克隆形成试验检测各组细胞的体外增殖能力;Transwell试验检测细胞的体外迁移、侵袭能力;western blot检测各组细胞STAT3/p-STAT3/c-myc的表达差异。结果与vector组相比,CPA4组MHCC97L细胞的增殖、迁移、侵袭能力均升高(P<0.05);与shNC组相比,shCPA4组MHCC97H细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低(P<0.05)。western blot结果显示,与vector组相比,CPA4组MHCC97L细胞p-STAT3、c-myc蛋白的表达水平升高(P<0.05);与shNC组相比,shCPA4组MHCC97H细胞p-STAT3、c-myc蛋白的表达水平降低(P<0.05)。结论CPA4可能通过激活STAT3信号通路促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

蛋白酶激活受体1在胰腺癌细胞中的表达、作用及其临床意义

目的 探讨蛋白酶激活受体1(PAR1)在胰腺癌细胞株Bxpc-3的表达及意义.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增法检测胰腺癌细胞株Bxpc-3中PAR1 mRNA的表达;设置对照组与实验组,实验组加PAR1激动荆(PAR1-AP),而对照组不加PAR1-AP,利用PAR1-AP观察其对胰腺癌细胞迁移和增殖能力的影响.结果 胰腺癌细胞中存在PAR1m RNA的高表达;实验组细胞迁移比对照组明显增快,实验组和对照组平均每视野细胞数为(148.425±16.123)个vs(54.012±4.614)个(t=21.950,P<0.01).实验组细胞增殖也高于对照组,实验组和对照组每分钟闪烁值为8 450±1159 vs 4 098±671(t=7.330,P<0.05).结论 PAR1在胰腺癌细胞中高表达,并能促进其迁移和增殖,表明PAR1与胰腺癌的转移能力和恶性程度密切相关;PAR1可以作为判断胰腺癌预后的生物学指标及治疗的新靶点.     

外周血中胰岛素生长因子检测与肝病的相关性研究

目的探讨肝病患者外周血中胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和IGF-Ⅱ水平与肝病的相关性及其检测意义。方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定各组肝病患者血清IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的含量;提取外周血白细胞总RNA,以-βactin作为内参,采用实时荧光定量RT-PCR技术测定各组IGF-ⅡmRNA表达;并采用放射免疫法检测各组血清中透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量。结果 (1)慢性病毒性肝炎轻、中度组血清IGF-Ⅰ水平明显高于对照组(P<0.05);慢性重度肝炎组、静止型肝硬化组、活动型肝硬化组及原发性肝癌组血清IGF-Ⅰ水平均明显低于对照组和慢性轻、中度肝炎组(P<0.05)。活动性肝硬化组血清IGF-Ⅱ水平明显高于对照组、静止性肝硬化组和慢性肝炎组(P<0.05);原发性肝癌组血清IGF-Ⅱ水平明显高于各组(P<0.05)。(2)活动型肝硬化组、原发性肝癌组外周血IGF-ⅡmRNA表达均较对照组明显增高(P<0.05)。(3)慢性重度肝炎组、肝硬化组及原发性肝癌组HA和PCⅢ含量逐渐升高(P<0.05)。结论外周血中细胞因子IGF-Ⅰ水平与肝病患者肝纤维化程度密切相关,可作为反映肝细胞损伤程度的指标,并对肝病病情的估测有一定意义;肝病患者外周血中IGF-Ⅱ可能是导致肝癌的重要原因之一,当肝病患者外周血中IGF-Ⅱ水平异常增高或过量表达时要警惕肝癌的发生。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

低频超声联合微泡增强脂质体介导Racl—shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响

目的研究低频超声联合微泡增强脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染前列腺癌PC3、DUl45细胞,并探索其对前列腺癌细胞凋亡、侵袭能力的影响。方法基础情况下Westernblot检测RWPE-1细胞、PC3细胞和DUl45细胞的Rac1蛋白表达。根据不同处理方式将细胞分为四组：PC3细胞对照组（A组）、超声加微泡联合脂质体转染PC3细胞组（B组）、DUl45细胞对照组（c组）及超声加微泡联合脂质体转染DUl45细胞组（D组）。通过蛋白质体外结合实验技术检测各组Racl蛋白的活性及表达;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况;细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果基础情况下前列腺癌PC3、DUl45细胞Racl蛋白表达均较正常前列腺细胞RWPE-1增加,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;低频超声携微泡介导Rac-1shRNA质粒转染细胞后,B组Racl蛋白表达量较A组表达减少,D组表达量较C组减少,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;早期细胞凋亡检测显示,B组高于A组,D组高于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;同期细胞侵袭力实验显示,B组穿膜细胞数少于A组,D组的穿膜细胞数少于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论低频超声联合微泡可促进脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞;通过抑制PC3、DUl45细胞中Racl蛋白表达可以促进癌细胞的早期细胞凋亡,同时可抑制癌细胞的侵袭能力。     

下调STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究。方法:人腺样囊性癌生长细胞株ACC 2常规培养,分别采用A组为空白转染组,B组转染阴性对照siRNA(NC),C组转染特异性的siRNA(siRNA组)转染进ACC2,采用qRT PCR和Western blot法检测转染后STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT检测转染后腺样囊性癌细胞增殖。结果:ACC2细胞转染STAT3 siRNA 48 h后,STAT3 mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。ACC 2生长72 h细胞转染后细胞增殖受到抑制,较对照组有显著性差异(P0.05)。结论:STAT3基因有可能成为腺样囊性癌细胞生长基因治疗中重要的靶基因。     

GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响及作用机制探讨

目的　通过检测G蛋白偶联受体家族C群5成员A（G protein coupled receptor C type group 5 member A, GPRC5A）在肝癌组织及细胞中的表达,探讨GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响及其相关作用机制。方法　收集2018年12月～2019年11月在解放军联勤保障部队第九六九医院行手术治疗的38例肝癌患者癌组织及配对癌旁正常组织样本;另选取人正常肝上皮细胞株HL-7702和人肝癌细胞株（HepG2,HCCLM3,HuH-7和MHCC-97H）进行研究。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肝癌组织、癌旁正常组织及肝癌细胞、正常肝上皮细胞中GPRC5A表达量。通过转染pcDNA3.1-GPRC5A质粒构建过表达GPRC5A肝癌细胞株,采用MTT实验和V-FITC/PI凋亡试剂盒分别检测过表达GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。采用活性氧指示剂DCFH-DA检测细胞中氧化应激相关因子活性氧（ROS）,NAD+/NADH和三磷酸腺苷（ATP）水平。采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白caspase-3及上皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平。结果　肝癌组织中GPRC5A表达较癌旁正常组织显著降低（0.34±0.09 vs 0.73±0.10）,差异有统计学意义（t=17.869,P<0.01）。肝癌细胞HepG2（0.35±0.06）,HCCLM3（0.38±0.10）,HuH-7（0.53±0.07）,MHCC-97H（0.67±0.06）中GPRC5A表达量显著低于人正常肝上皮细胞HL-7702中的GPRC5A表达量（1.00±0.08）,差异有统计学意义（t=5.716~11.258, 均P<0.05）。pcDNA3.1-GPRC5A组转染36 h细胞增殖吸光度（A）值（0.94±0.16）显著低于对照组（1.49±0.05）和pcDNA3.1组（1.45±0.07）（F=25.640,P<0.01）。GPRC5A过表达组VEGF（0.98±0.04）表达量较对照组（2.94±0.15）和pcDNA3.1组（2.89±0.11）显著降低（F=310.450,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中ROS（182.12±13.42）水平显著高于对照组（101.23±11.20）和pcDNA3.1组（98.30±10.26）（F=49.577,P<0.001）;NAD+/NADH（35.24±6.43）及ATP（55.34±6.51）水平显著低于对照组（100.25±12.41,100.17±14.36）和pcDNA3.1组（97.86±9.67,102.23±11.02）（F=42.338,17.077,P<0.05）。GPRC5A过表达组细胞凋亡率高于对照组和pcDNA3.1组;细胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表达量也高于对照组（1.00±0.11）和pcDNA3.1组（1.01±0.02）（F=202.843,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中p-STAT3表达量（0.43±0.06）显著低于对照组（1.00±0.13）和pcDNA3.1组（1.03±0.12）（F=29.476,P<0.001）;pcDNA3.1-GPRC5A组下游基因Socs3（0.47±0.05）,c-MYC（0.54±0.06）表达量也显著低于对照组（1.01±0.05,1.00±0.04）和pcDNA3.1组（0.98±0.09,1.02±0.06）（F=63.275,75.409,P<0.001）。肝癌组织中STAT3与GPRC5A表达量呈显著负相关（r=-0.746,P<0.01）。过转染pcDNA3.1-STAT3或pcDNA3.1-NLRP3后显著逆转了pcDNA3.1-GPRC5A对肝癌细胞的抑制作用（P<0.05）。结论　GPRC5A低表达可能通过调节STAT3/Socs3/c-MYC信号和炎症反应抑制了肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞的氧化应激和凋亡。