羟基喜树碱对人眼Tenon's囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱(HCPT)对人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts, HTFs)的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。

方法：取本院眼库新鲜眼球(<6h)的Tenon's囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养; 流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C(MMC)对HTFs细胞周期的影响; 台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起; RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。

结果：HTFs 体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT(0,0.25,1,4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05); 不同浓度MMC(0,0.025,0.1,0.4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4mg/L HCPT,0.4mg/L MMC作用HTFs 24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期; HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关; HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7 mRNA的表达阻断TGF-β信号通路实现的。     

氯化锂对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的影响

目的：观察氯化锂（Lithium chloride）对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenons capsule fibroblasts, HTFs）体外生长的抑制效应,并探讨其作用机制。 方法：磺基罗丹明（SRB）法和BrdU法检测细胞生长抑制率;采用流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Hoechst 33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学的改变。结果：在40-160mmol/L范围内,氯化锂能够抑制HTFs的增殖,且呈剂量与时间依赖性。氯化锂使HTFs阻滞于G2/M期,且能诱导细胞凋亡,高浓度组尤为明显。结论：氯化锂能抑制HTFs增殖,机制为诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G2/M期。     

阿昔洛韦对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖迁移的影响

目的:探索阿昔洛韦(ACV)对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增殖和凋亡的影响以及作用机制。方法:将HTFs分为ACV处理组和空白组;CCK8检测不同浓度梯度下的细胞增殖速率,划痕实验检测HTFs迁移能力,流式细胞术检测HTFs凋亡以及细胞周期。结果:与空白组相比,ACV处理组(终浓度分别为1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L)HTFs增殖速率显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。4.5mmol/L ACV处理组划痕细胞迁移率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P=0.0005),细胞周期G0/G1期峰值升高(P=0.0011),S期下降(P=0.0006),细胞周期被阻滞在G0/G1期。结论:阿昔洛韦可以通过阻滞HTFs周期促进细胞凋亡,抑制HTFs的增殖和迁移。     

氯化锂对人眼Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响

目的：观察氯化锂（Lithium chloride）对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenons capsule fibroblasts, HTFs）体外生长的抑制效应,并探讨其作用机制。 方法：磺基罗丹明（SRB）法和BrdU法检测细胞生长抑制率;采用流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Hoechst 33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学的改变。 结果：在40~160mmol/L范围内,氯化锂能够抑制HTFs的增殖,且呈剂量与时间依赖性。氯化锂使HTFs阻滞于G₂/M期,且能诱导细胞凋亡,高浓度组尤为明显。 结论：氯化锂能抑制HTFs增殖,机制为诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G₂/M期。     

羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制

背景研究表明,羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡,但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性,并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库,采用组织块培养法培养和传代HTFs,采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板,分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1,终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h,用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组,药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白,采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形,波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后,随着药物质量浓度的增加,对HTFs增生的抑制率增加,差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34,P=0．00;VP-16：F=62．60,P=0．00;HCPT＋VP-16：F=46．77,P=0．00）,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L,HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399,表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％,差异有统计学意义（F=18．23,P〈0．01）,其中HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs凋亡率较空白对照组明显升高,差异均有统计学意义（q’=15．67、16．32、26．88,P〈0．01）。Westernblot法检测结果表明,与空白对照组相比,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中活化型easpase．3、bax、p-JNK表达的灰度值明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,且HCPT＋VP-16处理组HTFs中上述各因子表达的灰度值较HCPT处理组、VP-16处理组明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,而easpase-3、JNK、Akt的表达无明显变化。与空白对照组比较,bcl-2、p-Akt在HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中的表达量明显下降,HCPT＋VP-16处理组较HCPT处理组、VP-16处理组的表达量明显减少,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论单独使用HCPT、VP-16均能诱导体外培养的HTFs凋亡,其作用均呈剂量依赖性,HCPT与VP-16联合应用有强协同作用。HTFs中p-JNK、bax的表达上调和p-Akt、bcl-2表达的下调参与联合用药引起的协同效应。     

转染Smad7基因的人眼球筋膜囊成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白及纤维连结蛋白表达的改变

目的观察转染Smad7基因的人眼球筋膜囊成纤维细胞（HTFs）Ⅰ型胶原蛋白和纤维连结蛋白表达的改变。方法用Nucleofector^TM核酸转染仪将含有Smad7的真核表达质粒转染至HTFs。采用实时定量逆转录聚合酶链反应法检测Ⅰ型胶原蛋白及纤维连结蛋白mRNA表达的改变。采用放射免疫法检测Ⅰ型前胶原羧端肽原（PICP）在培养液中浓度的改变,检测经转化生长因子β2（TGF-β2,10ng／ml）作用后以上指标的改变。以未转染HTFs和转染空质粒的HTFs作为对照。结果成功将含有Smad7基因的质粒转染至HTFs,并证明其Smad7基因mRNA表达明显升高。转染Smad7的HTFsⅠ型胶原蛋白mRNA表达率为（89．53±9．37）％,分别是对照组HTFs的40．47％和pCMV5-HTF8的37．94％。培养液中PICP浓度为（15．29±2．18）ug／L,分别是对照组HTFs的52．10％和pCMV5-HTFs的57．35％。转染Smad7的HTFs能够明显拮抗由TGF-β2作用引起的Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达和PICP浓度升高（P〈0．01）;无论是否有TGF-β2作用,转染Smad7的HITs纤维连结蛋白mRNA的表达与对照组相比,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论Smad7能降低HTFsⅠ型胶原蛋白mRNA表达和Ⅰ型胶原蛋白的合成,但对纤维连结蛋白mRNA表达无明显作用。     

紫杉醇对人Tenon囊成纤维细胞增生的抑制作用及机制

背景人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的异常增生是导致抗青光眼滤过手术失败的主要原因。寻找抑制HTFs增生的药物对抑制青光眼术后功能性滤过泡的瘢痕化有重要意义。目的观察紫杉醇对体外培养的HTFs增生、凋亡、细胞周期以及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达的影响。方法收集抗青光眼滤过术中切除的人眼Tenon囊组织,用组织块培养法培养HTFs并进行传代,取3～6代细胞用于实验。采用小鼠抗人角蛋白抗体、小鼠抗人波形蛋白抗体、小鼠抗人结蛋白抗体、小鼠抗人S-100抗体行免疫组织化学染色鉴定培养的HTFs。在培养基中分别加入0、1×10^-8、1×10^-8、1×10^-6mol／L紫杉醇,采用实时细胞电子分析系统（RT—CES）观察不同浓度紫杉醇作用后HTFs的细胞指数变化;采用DAPI染色法观察各组细胞的凋亡情况;用流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用后HTFs各细胞周期比例;采用实时定量PCR（real—timePCR）和ELISA法检测各组HTFs中MMP-1mRNA和蛋白的表达量,分别以MMP-1mRNA／GAPDHmRNA和MMP-1蛋白质量浓度（μg／L）表示。结果组织块原代培养7d内可见细胞游出,呈长梭形和不规则三角形,培养的细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,而抗角蛋白抗体、抗结蛋白抗体和抗S-100抗体染色阴性。培养基中加入紫杉醇作用24h后,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇组平均细胞指数值分别为1．09±0．191、0．665±0．093和0．473±0．117,均明显低于0mol／L紫杉醇组的1．514±0．283,差异均有统计学意义（均P=0．000）;紫杉醇作用后,HTFs的细胞核内可见呈DAPI蓝色荧光的颗粒状物质,荧光强度随着紫杉醇浓度的增加而增强。l×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇分别作用12h后,G,／M期HTFs的比例分别为（9．20±0．80）％、（12．37±0．45）％和（13．80±0．35）％,明显高于0mol／L紫杉醇组的（7．17±0．50）％,差异均有统计学意义（P=0．005、0．000、0．000）。与0mol／L紫杉醇组比较,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用30min后HTFs中MMP-1mRNA的相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义（均P=0．000）;1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用24h后,HTFs中MMP-1蛋白的表达量均明显低于0mol／L紫杉醇组,差异均有统计学意义（P=0．010、0．002、0．001）。结论1×10^-8～1×10^-6mol／L紫杉醇可抑制体外培养HTFs的增生,诱导细胞凋亡,阻断细胞的有丝分裂,其作用机制可能与下调细胞中MMP-1的表达有关。     

芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增生是滤过手术失败的丰要原因,寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率. 目的 观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制.方法 斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养,免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs.取第3～5代HTFs接种于96孔板中,加入0、20、40、80、160 μmol/L芹黄素后继续培养,于24、48、72 h后分别取一块96孔板,在酶联免疫检测仪上检测560 nm波长处各组细胞的吸光度(A560)值,磺基罗丹明B(SRB)法测定细胞的增生能力.分别在培养基中加入40、80、160 μmol/L芹黄素,同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10 μg/L BrdU,继续培养48 h,在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片,计算BrdU的标记率,以未添加任何芹黄素(0μmol/L)组为对照组.用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变,采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化. 结果 培养的细胞生长状态良好,免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应,为细胞质中均匀的绿色荧光,确定培养的细胞为HTFs.SRB法检测结果显示,HTFs的增生值(A560)随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降,同浓度芹黄素组HTFs A560值随着作用时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义(F组别=480.306,P=0.000;F时间 =555.144,P=0.000).0、40、80 μmol/L芹黄素作用HTFs 48 h后BrdU的标记率分别为(87.860±0.632)％、(61.520±4.306)％、(23.480±4.472)％,各组之间的总体比较差异有统计学意义(F=299.347,P=0.000),其中40 μmol/L、80 μ mol/L芹黄素组HTFs BrdU的标记率均明显低于0 μmol/L芹黄素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).Hoechse 33258染色发现,不同浓度芹黄素组的细胞数目减少,随着芹黄素浓度的增加,细胞核固缩和变形的细胞数目增加.流式细胞术检测发现,随着芹黄素浓度的增加,G0/G1期细胞的百分数逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的百分数逐渐下降,差异均有统计学意义(FG0/G1 =58.621,P=0.000;Fs=32.357,P=0.001;Fc2/M =83.998,P=0.000).0、40、80、160 μmol/L芹黄素作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(4.77±0.21)％、(13.24-±1.35)％、(18.33±1.86)％、(31.58±2.77)％,4个组的总体差异有统计学意义(F=204.791,P＜0.05). 结论 芹黄素通过诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G0/G1期而抑制HTFs的增生,其作用呈剂量和时间依赖性.     

抗青光眼术后滤过泡瘢痕化组织人Tenon囊成纤维细胞的生长特性

背景 抗青光眼滤过术后瘢痕组织中的主要细胞成分是人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）,探讨滤过泡瘢痕组织中HTFs的生长特性可为抗青光眼滤过术后预防瘢痕形成的研究提供实验基础. 目的 研究抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化组织中HTFs的体外生长特性. 方法 收集因抗青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化行二次手术的患者8例8眼的Tenon囊组织（4 mm＆#215;5 mm）,同期以同样的取材方法收集行斜视矫正术患者8例8眼的正常Tenon囊组织.采用组织块贴壁法将Tenon囊组织进行原代培养,用鼠抗人波形蛋白细胞免疫荧光法鉴定培养的HTFs,并用巢式PCR法检测培养的HTFs中是否受到支原体的污染.分别于第0、4、7、11、14天以发光法细胞活力检测HTFs,并绘制各组细胞的生长曲线,计算细胞群体倍增时间（PDT）.比较瘢痕组和正常组HTFs形态学和PDT的差异;将瘢痕组第5代与第15代HTFs的形态及PDT进行比较,评价细胞传代生长特性的稳定性. 结果 HTFs原代培养1～2周达到融合,呈长梭形,形态符合HTFs,传代细胞4～6 d达到融合.瘢痕组与正常组HTFs的生长特性相近,对鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性反应,PCR检测未见支原体反应条带.瘢痕组和正常组HTFs的PDT分别为（20.54±3.51）h和（18.86±2.91）h,差异无统计学意义（t=0.634,P=0.561）.细胞培养后第4、7、11和14天,瘢痕组HTFs的细胞数与正常组比较差异均无统计学意义（t=2.663,P=0.081;t=0.194,P=0.863;t=3.338,P=0.053;t=0.627,P=0.565）,2个组的HTFs随培养时间的延长显示出一致的增生曲线.瘢痕组第5代和第15代细胞PDT分别为（20.54±3.51）h及（22.84±4.15）h,差异无统计学意义（t=0.733,P=0.505）;第5代与第15代间细胞生长曲线可见其增生能力均稳定,两代间HTFs在各时间点的细胞数差异均无统计学意义（t=1.528,P=0.235;t=0.269,P=0.786;t=1.954,P=0.139;t=0.730,P=0.506）.结论 抗青光眼术后滤过泡瘢痕化患者的HTFs体外培养生长状态良好,增生能力稳定,是进行青光眼术后滤过区抗纤维化研究的良好靶细胞.     

miR-200a对结膜成纤维细胞增生和迁移的调控作用及其机制

背景 青光眼滤过性手术后手术区域瘢痕化是导致抗青光眼手术失败的主要因素,因此越来越多的研究关注瘢痕形成的原因和过程. 目的 比较青光眼滤过术后滤过区人瘢痕组织来源成纤维细胞(HSFs)与人正常Tenon囊来源成纤维细胞(HTFs)增生迁移能力的差异以及微小RNA200a(miR-200a)对结膜成纤维细胞生物学行为的抑制作用,并探讨产生这种差异的可能机制. 方法 收集斜视手术过程中切取的正常Tenon囊组织和青光眼滤过术后手术区瘢痕组织,对成纤维细胞进行原代培养,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测不同来源成纤维细胞的增生能力;采用细胞划痕试验检测细胞的相对迁移距离;采用实时荧光定量PCR法检测不同来源成纤维细胞中转化生长因子-B1(TGF-β1)mRNA和miR-200a mRNA的表达.于HTFs培养基中分别加入0、1、2和5 ng/ml TGF-β1拟似物,于HSFs培养基中分别加入0.00、0.25、0.50、1.00μs/mlTGF-β1抑制剂,细胞处理24 h,采用CCK8法检测细胞增生能力;用2 ng/ml TGF-β1拟似物处理HTFs,用1.00 μg/ml TGF-β1抑制剂处理HSFs,分别采用划痕法检测不同处理组细胞的相对迁移距离,采用实时荧光定量PCR法检测不同处理组细胞中miR-200a mRNA的相对表达量. 结果 原代培养的细胞胞体较大,呈纺锤形或星形,细胞核呈卵圆形,对角蛋白抗体呈弱阳性反应,对波形蛋白抗体呈阳性反应.HSFs的增生值(A值)为1.476±0.110,明显高于HTFs的0.958±0.074,差异有统计学意义(t=24.900,P=0.016);HSFs中TGF-β1 mRNA相对表达量高于HTFs,是HTFs的(1.739±0.205)倍,差异有统计学意义(t=6.358,P=0.024);HSFs中miR-200a mRNA的相对表达量明显低于HTFs,是HTFs的(46.23±10.78)％,差异有统计学意义(t=7.394,P=0.018).与添加2 ng/ml TGF-β1拟似物的HTFs相比,添加TGF-β1拟似物的HSFs相对迁移距离增加了(3.533±0.402)倍,miR-200a mRNA相对表达量低至(45.4±7.3)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与添加1.00 μg/ml TGF-β1抑制剂的HTFs相比,培养基中添加TGF-β1抑制剂后,HSFs的相对迁移距离幅度降低至(64.3±6.5)％,miR-200a mRNA相对表达量明显增加(3.106±0.415)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 HSFs的增生及迁移能力均明显强于HTFs,可能与HSFs中miR-200a表达量低有关.MiR-200a与TGF-β1在调控成纤维细胞的增生和迁移能力方面发挥相反的作用.     

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV—tk／GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV—tk基因HTFs（HTFs—tk）与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合，加入5μg／ml更昔洛韦作用5d，MTT法检测对HTFs的杀伤作用；染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯（GJIC）的能力；免疫细胞化学检测Cx43分布；RT—PCR及Westernblot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs—tk／HTFs比例增加而增强，高细胞接种密度组明显强于低密度组；染料通过GJIC传输6级以上；Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触，Cx43介导GJIC可能是HSV—TK／GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制，HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。     

人眼Tenon囊成纤维细胞缝隙连接细胞间通讯的检测

目的:观察体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)缝隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能及其构成蛋白connexin43(Cx43)的表达及分布。方法:锐刀划痕罗氏黄(lucifer yellow)荧光染料传输法观察GJIC功能;RT-PCR及Western blot分别检测Cx43 mRNA及蛋白表达;免疫细胞化学方法检测Cx43的分布。结果:荧光染料自划痕线向邻近未损伤细胞传输达6级细胞以上,同时检测到Cx43 mRNA与蛋白的表达;免疫细胞化学法观察到Cx43分布于细胞膜。结论:培养的HTFs具有较强的GJIC功能,通过Cx43介导GJIC赋予细胞能够相互之间传递信息的能力,提示在创伤愈合过程中GJIC对成纤维细胞功能同步化方面发挥重要作用。     

骨桥蛋白及其单克隆抗体1A12对人Tenon's囊成纤维细胞的调控作用

目的：探讨骨桥蛋白（OPN）对人Tenon's囊成纤维细胞（HTFs）的调控作用。方法：实验研究。采用不同浓度（0、0.05、0.5、5 μmol/L）的OPN对HTFs进行处理,采用MTT法检测HTFs的增殖速度,采用细胞划痕实验检测HTFs的移行速度。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测不同浓度的OPN处理后HTFs的血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β（TGF-β）的mRNA水平变化。采用Western blot检测不同浓度的OPN处理后HTFs的I 型胶原蛋白的表达。采用单因素方差分析对数据进行比较。结果：不同浓度OPN处理组HTFs增殖能力和移行速度差异有统计学意义（F =174.5、297.1,P ＜0.01）。OPN处理组的HTFs增殖能力增强,移行速度加快,而且随着OPN的浓度增加而增加。给予OPN单克隆抗体1A12（5 μmol/L OPN+20 μg/ml 1A12）处理后HTFs增殖和移行速度变慢。不同浓度的OPN处理后HTFs中VEGF和TGF-β的mRNA含量变化差异无统计学意义。OPN处理后HTFs中I型胶原蛋白的蛋白表达增加,呈浓度依赖性（F =30.2,P ＜0.01）。结论：OPN能促进HTFs增殖和移行,呈浓度依赖性,该效应可被OPN抗体1A12抑制。上调OPN可以诱导HTFs中I型胶原蛋白的表达,其单克隆抗体1A12能抑制这种效应。     

汉防己甲素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的研究汉防己甲素（Tet）抑制人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）的凋亡效应。方法用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定。通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用。结果人眼TCFs体外生长良好。透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G0／G1期细胞减少22．2％,S期细胞增加20．53％,G2／M期细胞增加1．6％,Tet抑制TCFs细胞周期于G,期,Tet组凋亡率明显高于对照组（P=0．000）。结论Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对视网膜色素上皮细胞增殖及相关因子表达的影响

目的　研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞增殖及相关因子表达的影响。方法　体外培养人RPE细胞,设阴性对照组,40 mg·L^-1、 80 mg·L^-1、 160 mg·L^-1 EGCG 3个浓度药物处理组。利用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达,Western blot检测色素上皮衍生因子受体（pigment epithelium derived factor receptor,PDGFR-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）和IκB蛋白的表达情况。结果　MTT实验结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG药物处理组随着作用时间的延长,对人RPE细胞的增殖抑制作用也逐渐增强;随着药物浓度的增加,EGCG的增殖抑制作用也增强（均为P<0.05）。160 mg·L^-1 的EGCG 在72 h的细胞增殖抑制率达到81.11%。随着EGCG浓度的增加,培养的人RPE细胞中G1期和G2期细胞比例减少,S期细胞比例增加,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组S期细胞比例与阴性对照组相比增加极显著（均为P<0.05）。EGCG对细胞周期的影响作用具有明显的剂量依赖性。与阴性对照组相比,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组细胞内的P21和P27 mRNA表达均有不同程度的升高（均为P<0.05）;40 mg·L^-1 EGCG药物处理组与阴性对照组相比,P27 mRNA表达也增高（P=0.015）,而P21 mRNA表达增高不明显（P=0.824）。P21和P27 mRNA表达量与EGCG浓度呈明显量效依赖关系（均为P<0.05）。Western blot结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG作用人RPE细胞后,NF-κB蛋白表达随着浓度的增加而减少,各药物处理组与阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG亦能够抑制人RPE 细胞IκB蛋白和PDGFR-α蛋白表达,与相应阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。EGCG对人RPE细胞内PDGFR-α、NF-κB和IκB的蛋白表达抑制作用呈明显的浓度依赖性（均为P<0.05）。结论　EGCG可以有效地抑制人RPE细胞的增殖,其机制可能与EGCG将人RPE细胞阻滞于S期,上调P21及P27 mRNA表达,下调PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白表达有关。     

碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞增殖及移行作用的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对体外培养的人晶状体上皮细胞（HLEC）增殖及移行作用的影响.方法 在无血清培养液培养的HLEC中分别加入不同终浓度的bFCF（0.01、0.1、1、10及100 μg/L）,MTT法测定其促细胞增殖的情况;流式细胞仪分析细胞周期;HLEC损伤愈合模型,观察不同终浓度bFGF处理24 h后HLEC的移行情况.结果 bFGF浓度为0.1、1、10、100 μg/L时,其对HLEC细胞有明显的促增殖作用,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,100 μg/L作用24 h增殖率最大,达112.78%,作用强度呈浓度时间依赖性.bFGF通过促进细胞周期变化,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多,通过促进HLEC由G0向G1的转化来促进细胞的增殖;bFGF浓度1、10、100 μg/L作用24 h.可明显促进HLEC的移行,其移行能力分别为27.21%、154.42%、和238.77%,与阴性对照组相比,差异有显著统计学意义（P〈0.01）.结论 bFGF可促进HLEC的增殖和移行,是HLEC强有力的有丝分裂原和促移行因子.     

羟基喜树碱对青光眼滤过术后球结膜下成纤维细胞凋亡的影响及其机制研究

【摘要】 目的 观察羟基喜树碱（hydroxycamptothecin,HCPT）对青光眼滤过术失败的球结膜下瘢痕组织成纤维细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。设计 实验研究。研究对象 球结膜下瘢痕组织成纤维细胞。方法 体外培养青光眼滤过手术失败的球结膜下瘢痕组织成纤维细胞并鉴定。应用不同浓度的HCPT作用于成纤维细胞。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用RT-PCR方法检测HCPT作用下,有或无广谱caspase阻断剂（Z-VAD-FMK）时,凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA量的变化。主要指标 凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA量的变化。结果 流式细胞检测显示,0.06、0.25、1.0、4.0 mg/l的HCPT作用于成纤维细胞24小时后,其凋亡率分别为0.87%、4.97%、5.76%、33.1%（P<0.05）。RT-PCR法显示,HCPT作用时caspase-3和caspase-9 mRNA的量较空白组明显增多,而caspase-8 mRNA的量较空白组减少;加入Z-VAD-FMK后,caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA的量均减少。结论 HCPT在体外可诱导青光眼滤过手术球结膜下瘢痕组织成纤维细胞发生凋亡,且具有浓度依赖性,该凋亡可能通过caspase-3和caspase-9途径来实现。（眼科,2012,21：273-277）     

TGF-β_1对甲状腺相关性眼病眼外肌成纤维细胞Smads基因表达的影响

目的：测定转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）对甲状腺相关性眼病（thyroid-associatedophthalmopathy,TAO）患者纤维化眼外肌来源的成纤维细胞（orbital fibroblasts,OF）细胞Smad3,Smad4,Smad7基因表达的影响。方法：采用实时荧光定量逆转录聚合酶连反应（real-timequantitative RT-PCR）观察5μg/L TGF-β1刺激OF在不同时间点（0h;15,30min;1,2,4h）表达Smad3 mRNA,Smad4 mRNA,Smad7 mRNA的变化。结果：5μg/L TGF-β1刺激OF15min后,Smad3 mRNA的表达量已显著增加,为对照组的10.71倍,于1h达顶峰,为对照组的25.07倍（P〈0.01）,持续近2h,然后呈下降趋势,4h基本恢复正常;5μg/L TGF-β1刺激OF15min后,Smad4 mRNA的表达量开始增加,为对照组的1.54倍,于1h达顶峰,为对照组的15.99倍（P〈0.01）,然后呈下降趋势,4h基本恢复正常;5μg/L TGF-β1刺激OF30min后,Smad7 mRNA的表达量明显开始增加,为对照组的3.21倍,持续至4h为对照组的14.66倍（P〈0.01）。结论：TGF-β1可活化眼眶成纤维细胞Smads信号通路。在一定的时间范围内,诱导OF表达Smad3 mRNA和Smad4 mRNA呈先增加后下降的趋势,而Smad7 mRNA表达则呈现持续增加的趋势,说明TGF-β1/Smads这一纤维化相关的经典信号转导通路可能在TAO眼外肌纤维化机制中发挥了重要的作用。     

NO-Fluvastain对体外培养的人LECs增生作用的实验研究

目的 研究NO-Fluvastain对体外培养的人晶状体上皮细胞(LECs)增生的影响及其作用机制.方法 用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增生;流式细胞仪测定细胞周期;RT-PCR测定细胞周期调控蛋白CyclinE mRNA和P21waf1 mRNA表达.结果MTI 检测显示NO-Fluvastain对体外人LECs的增生具有显著抑制作用,并且表现出时间和剂量依赖关系.流式细胞仪检测发现:NO-Fluvastain可阻滞人LECs由G0/G1期向S期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.RT-PCR检测发现:NO-Fluvastain可抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waft.mRNA表达.与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 NO-Fluvastain通过抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waf1 mRNA表达,使人LECs阻滞于G0/G1期,从而抑制人LECs增生.     

榄香烯对人晶状体上皮细胞增生及细胞周期的影响

目的探讨中药单体榄香烯（Ele）对人晶状体上皮细胞株（HLE-B3）增生及细胞周期的影响。方法利用重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）诱导HLE-B3增生,将80mg/L的Ele作用在处于增生状态下的HLE-B324h后,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测Ele对HLE-B3增生的抑制作用;苏木精-伊红染色观察Ele作用后HLE-B3细胞形态的改变;流式细胞术（FCM）检测Ele对HLE-B3细胞周期的影响。结果MTT检测显示：rhbFGF组HLE-B3吸光度值（0.5990±0.0531）较正常组（0.4091±0.0422）显著升高,Ele组HLE-B3吸光度值（0.4500±0.0614）较rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%（P〈0.01）。苏木精-伊红染色后光学显微镜下观察到rhbFGF组较正常组细胞数量增多,细胞形态清晰,胞浆丰富,胞核清晰,交织呈网状结构;Ele组细胞数量明显减少,胞浆减少,轮廓不清,交织的网状结构减少,甚至有的细胞变圆,细胞核凝集,见核固缩现象,胞浆嗜酸性染色。FCM检测细胞周期变化时发现：G1期的细胞在rhbFGF组（42.062%±1.270%）较正常组（46.422%±3.765%）减少（P〈0.05）,Ele组（60.665%±2.069%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）;S期的细胞在rhbFGF组（51.647%±1.123%）较正常组（31.842%±2.798%）明显增加（P〈0.01）,Ele组（30.222%±3.429%）较rhbFGF组明显减少（P〈0.01）;G2期的细胞在rhbFGF组（6.288%±0.966%）较正常组（21.735%±3.806%）明显减少（P〈0.01）,Ele组（9.112%±1.659%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）。结论Ele能通过改变HLE-B3细胞形态及细胞周期的进程而有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增生,有望成为防治后发性白内障的理想药物。