荧光金示踪技术评价面神经损伤裸鼠模型

目的 建立免疫缺陷小鼠周围性面瘫模型并结合荧光金逆行示踪技术进行评价,并与相应野生型小鼠模型比较.建立稳定的免疫缺陷小鼠面神经损伤模型评价系统,为进一步揭示外伤性面瘫的神经免疫机制提供模型基础.方法 外科无菌手术方法切断裸小鼠、野生型BABL/c小鼠面神经出茎乳孔主干,分别于脑干取材前2天行面神经断端涂抹荧光金示踪剂.面瘫第14天灌注固定动物后,标本自头侧至尾侧行连续冰冻切片,荧光显微镜下观察面神经运动神经元情况.用Image Pro Plus5.1软件计数神经元数量.结果 面神经轴切损伤后14天,荧光切片面神经运动神经元核团显示清晰,便于计数;裸小鼠组与野生型组神经元数目有显著性差异(分别为2423±20,2748±60,P=0.0011).结论 荧光金逆行示踪技术结合裸鼠面神经损伤模型评价系统是有效、易行的,为进一步揭示外伤性面瘫中以T细胞行为研究为中心的神经免疫机制提供模型基础.     

裸鼠面瘫模型诱导型一氧化氮合酶表达分析

目的 结合形态学技术分析免疫缺陷小鼠的面神经损伤特点,为进一步深入探讨面神经修复再生的神经免疫病理机制提供实验基础.方法 制备周围性面神经外伤模型.分别于术后3d、2周灌注固定动物,收集脑干切片,免疫组化分析模型小鼠面运动神经元诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)...     

CD4+T细胞移植对裸鼠面神经损伤模型面运动神经元存活的影响

目的 探讨面神经损伤动物模型中CD4+ T细胞与损伤的面运动神经元(facial motoneuron,FMN)之间的关系,为揭示面神经损伤后修复及再生中的免疫病理机制提供实验证据.方法 磁珠分选法分离野生型BALB/c小鼠CD4+ T细胞,经尾静脉移植于相同遗传背景的裸小鼠,并以PBS为对照.1周后均制备成周围性面神经损伤模型,指定时间在面神经断端涂抹荧光金示踪剂.术后3 d灌注固定动物,收集脑于切片,荧光显微镜下观察.采用Image Pro Plus 5.1图像分析软件计数FMN,并比较不同组之间的差异.结果 术后3 d CD4+ T细胞移植组FMN计数为3444.5±84.2(-x±s,下同),对照组FMN计数为3013.2±65.3,差异具有统计学意义(t=5.52,P=0.0003);而CD4+ T细胞移植组与野生型小鼠神经元计数比较,差异无统计学意义(t=0.49,P=0.6347).结论 CD4+ T细胞可以保护裸鼠受损伤的FMN,使其数量达到野生型的水平.     

小鼠面神经损伤急性期T细胞CD69表达的研究

目的 应用流式细胞技术探讨面神经损伤急性期T细胞功能状态及其病理生理意义，为揭示外伤性面瘫的神经免疫机制提供理论依据。方法 制备面神经轴切损伤模型小鼠，分别于损伤后3天、2周分离小鼠肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node，MLN）、术侧颈部引流淋巴结（cervical draining lymph node，CDLN）细胞，进行双色免疫荧光标记。以流式细胞术分析T细胞上CD69分子的表达情况。结果手术后3天，面神经损伤组颈部引流淋巴结T细胞CD69表达的百分率与相应手术对照组相比较差异有显著性（P=0．0457）；而神经损伤组、手术对照组肠系膜淋巴结T细胞CD69表达的百分率与正常小鼠相比较差异无显著性（P值分别为0．2817、0．2724）。面神经轴切损伤后2周，神经损伤组CDLN的T细胞CD69表达的百分率仍然维持在较高水平，神经损伤组MLN的T细胞CD69表达的百分率出现上调，与相应对照组及术后3天时相比较差异均有显著性（P值分别为0．0082、0．0133）。结论 面神经轴切损伤3天、2周时，颈部引流淋巴结存在T细胞活化并上调；在2周时。肠系膜淋巴结也出现低水平的T细胞活化。提示面神经损伤急性期。伴随着一个局部免疫应答向全身免疫应答转化的过程，在一定程度上有利于机体协调控制免疫应答的规模与方向。     

面神经损伤后糖皮质激素受体α在面神经核及外周淋巴组织的表达

目的探讨面神经损伤后,糖皮质激素受体α(GRα)在面神经核团及外周淋巴组织的表达和变化规律。方法建立新西兰兔面神经损伤模型,分别于损伤后24?h、48?h、72?h、 7?d、14?d取出面神经核团和颈部淋巴结,采用免疫组化SP法,观察糖皮质激素受体的表达情况。结果糖皮质激素受体α在面神经核团及外周淋巴细胞中均有表达;糖皮质激素受体α表达增高在面神经核中出现在损伤48?h后,颈部淋巴结出现在损伤72?h后。结论糖皮质激素受体α表达在面神经核团及外周淋巴细胞胞核及胞质中,在面神经受到损伤后其表达量增高,而且神经损伤较单纯外伤可以引起较长时间的局部炎症反应。     

面神经损伤后面运动神经元两种神经营养因子的表达

目的研究脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor ,BDNF）和成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）在大鼠面运动神经元（facial motoneuron,FMN）的正常分布和面神经损伤再生过程中的表达改变。方法制造大鼠右面神经损伤模型,应用原位杂交和免疫组化检测BDNF mRNA及其蛋白和FGF-2 mRNA及其蛋白在FMN的表达,结合计算机图像分析技术测定双侧FMN反应产物的阳性细胞数比和灰度值百分比。结果 BDNF mRNA及其蛋白阳性细胞分布于正常面神经核各亚核,除神经元细胞外其周围胶质细胞也染色,面神经损伤后1 d,损伤侧面神经核BDNF mRNA及其蛋白阳性神经元细胞和胶质细胞数量及染色强度均快速增高;FGF-2 mRNA及其蛋白主要分布于正常面神经核腹侧亚核神经元胞浆中,面神经损伤后损伤侧FMN中FGF-2 mRNA信号7 d开始增强,而其蛋白反应产物则在损伤后3和7 d显著减少。结论正常FMN可能存在BDNF的自分泌和旁分泌作用及FGF-2的自分泌作用;面神经损伤早期,靶源性FGF-2的减少导致FMN中FGF-2蛋白表达下降,提示应用外源性FGF-2可能有助于神经元胞体代谢和功能的恢复。     

神经转接与跨面神经移植修复面神经的手术进展

周围性面瘫的原因很多,有些面瘫在经过观察、保守治疗或是面神经减压术后可以恢复,而有一些则会因神经的断裂、缺损和不可逆的神经损伤而造成永久性的面瘫。对于面瘫的治疗,最有效的解决办法是迅速修复受损的面神经。周围性面瘫的手术治疗方法多种多样,包括面神经减压术、面神经端端吻合术、神经移植术、跨面神经移植术、神经转接术等,以及游离肌肉植入术和相关整形手术等。对于不同原因造成的面瘫,治疗方法会由于面瘫的病因、术者的专业知识及习惯、发生面瘫的时间和进行治疗的时机不同而有着不同的选。本文重在描述面神经缺损、断裂或发生了不可逆性损伤后的手术治疗,故在本文中不介绍面神经减压手术,而是对面神经功能重建,尤其是面神经吻合及移植中不同术式的手术方法,进行简单描述并讨论各手术方法的优缺点、适应症等,以期对以后的治疗中的选择有所裨益。     

单纯疱疹病毒性面神经炎的动物模型

目的建立单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virustype 1，HSV-1）感染造成的面神经麻痹动物模型，研究HSV-1与面神经麻痹之间的关系。方法Balb／c小鼠66只，切断双侧面神经耳后支，右侧神经断端接种HSV-1，左侧接种胎牛血清作为对照。观察小鼠全身情况、双侧面肌运动的对称性；颞骨连续切片HE染色；颞外段面神经锇酸染色；双侧面神经、脑干、三叉神经节、脊髓行PCR检测HSV-1 DNA片断。结果28只小鼠（42．42％）于接种后2～5d发生右侧面神经麻痹，病程持续3～6d后恢复。38只未发生面神经麻痹。与对侧比较，颞骨连续切片显示面神经麻痹鼠右侧神经肿胀、神经周围问隙变小、炎细胞浸润，面神经横截面秽面神经管横截面积的比值明显变大；颞外段面神经出现神经髓鞘变薄、脱失。面神经麻痹鼠和无面神经麻痹鼠的部分神经组织中检测到HSV DNA。结论在面神经耳后支断端接种HSV-1可以引起小鼠暂时性面神经麻痹，可能是由于病毒逆行转运引起面神经炎，进而神经肿胀受压发生面神经麻痹。     

靶肌肉注射胶质细胞源性神经营养因子对面神经损伤修复的作用

目的 通过靶肌肉注射胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),观察其对面神经压榨损伤后大鼠功能恢复、神经形态学及GDNF在中枢面神经元中表达的影响,探讨经靶肌肉注射GDNF治疗周围性面瘫的可行性及作用机理。方法 SD大鼠随机分为假手术组(只暴露右侧面神经主干)、模型组(面神经主干压榨)、实验对照组(面神经主干压榨+颊肌注射生理盐水)和实验组(面神经主干压榨+颊肌注射GDNF),通过颊肌电生理、面瘫症状评分观察大鼠的神经功能恢复, Masson染色观察颊肌纤维形态学变化、甲苯胺蓝染色观察面神经形态学变化、Western Blot检测面神经元中GDNF的表达。结果 ①大鼠面瘫症状评分：假手术组无面瘫表现,评分为0分,造模后各组大鼠均出现周围性面瘫表现,评分均为5分;术后第28天,实验组大鼠面瘫症状已基本完全恢复,模型组及实验对照组较前有不同程度改善但未完全恢复,评分均＞3分;②颊肌电生理：各组造模后与假手术组相比,峰潜伏期有不同程度延长、最大振幅有不同程度下降;随时间的推移,实验组峰潜伏期较模型组及实验对照组明显缩短(P<0.05),最大振幅较其明显上升(P<0.05);③甲苯胺蓝染色：模型组、实验对照组、实验组术后均出现神经纤维形态不规则,外膜不连续不清晰,轴突数量减少。术后第28天,实验组面神经形态与假手术无明显差异,较模型组及实验对照组有明显恢复;④Masson染色：各组造模后肌纤维数量减少,肌肉组织占比面积减少;实验组肌纤维形态较模型组及实验对照组恢复快,至术后第28天,肌纤维形态接近正常(P<0.05);⑤Western Bolt检测：各组造模后中枢面神经元组织GDNF的蛋白表达下降,观察期内逐渐增强;与模型组及实验对照组相比,术后各时间点,实验组中枢面神经元组织GDNF的蛋白表达显著增强(P<0.01)。结论 靶肌肉注射GDNF可作为改善周围神经损伤的有效给药方式之一,促进神经纤维修复、靶肌肉功能的恢复及中枢神经系统对周围损伤神经的修复。     

面神经损伤后面运动神经元两种神经营养因子的表达

目的 研究脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF)和成纤维细胞生长因子－2（fibroblast growth factor-2,FGF-2)在大鼠面运动神经元（facial motoneuron,FMN)的正常分布和面神经损伤再生过程中的表达改变。方法 制造大鼠右面神经损伤模型，应用原位杂交和免疫组化检测BDNF mRNA及其蛋白和FGF－2mRNA及其蛋白在FMN的表达，结合计算机图像分析技术测定双侧FMN反应产物的阳性细胞数比和灰度值百分比。结果 BDNF mRNA及其蛋白阳性细胞分布于正常面神经核各亚核，除神经元细胞外其周围胶质细胞也染色，面神经损伤后1d，损伤侧面神经核BDNF mRNA 春蛋白阳性神经元细胞和胶质细胞数量及染色强度快速增高；FGF－2mRNA及其蛋白主要分布于正常面神经核腹侧亚核神经元胞浆中，面神经损伤后损伤侧FMN中FGF－2mRNA信号7d开始增强，而其蛋白反应产物在损伤后3和7d显著减少。结论 正常FMN可能存在BDNF的自分泌和旁分泌作用及F GF－2的自分泌作用；面神经损伤早期，靶源性FGF－2的减少导致FMN中FGF－2蛋白表达下降，提示应用外源性FGF－2可以有有助于神经元胞体代谢和功能的恢复。     

小鼠单纯疱疹病毒性面瘫的预防和复发模型的建立

目的建立1型单纯疱疹病毒（herpes　simplex　virus　type1，HSV-1）潜伏感染再激活导致小鼠面瘫的模型，观察免疫球蛋白（IgG）和干扰素对单纯疱疹病毒性小鼠面瘫的预防效果。方法64只4周龄雌性Balb／c小鼠，用26G针头搔刮小鼠耳廓背面近耳根部皮肤，左耳接种HSV．125山，总剂量1．7×10^7空斑形成单位（plaque　forming　unit，PFU）／ml，右耳接种25山磷酸盐缓冲液作为对照，制作小鼠面瘫潜伏模型。按数字表法将小鼠随机分为3组：第一组20只，每天腹腔注射IgG1ml／kg，连续注射3d，待出现面瘫后，面瘫小鼠继续注射3d；第二组20只，腹腔注射干扰素1．5×10’IU／kg，连续3d，待出现面瘫后，面瘫小鼠继续注射3d；第三组24只，腹腔注射相应量的生理盐水作为对照。观察小鼠面瘫情况，8周后取面瘫恢复的小鼠，腹腔注射环孢素50mg／kg，建立面瘫复发模型。处死小鼠，分离双侧面神经和三叉神经节，多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测HSV-1 DNA的表达。结果第一组小鼠面瘫率50％，面瘫持续时间（7．2±2．2）d（x±s，下同）；第二组小鼠面瘫率30％，面瘫持续时间（4．5±1．8）d；第三组小鼠面瘫率67％，面瘫持续时间（8．9±2．6）d。经统计学分析，IgG不能有效降低面瘫发生率及缩短面瘫持续时间（P值均〉0．05），而干扰素可以有效降低面瘫发生率并缩短面瘫持续时间（P值均〈0．05）。注射环孢素后3只面瘫恢复小鼠（3／28）再次出现面瘫，复发率11％。所有面瘫复发小鼠均检测到HSV-1DNA，而未复发小鼠均未检测出HSV-1DNA。结论HSV-1潜伏感染再激活可能是单纯疱疹病毒性小鼠面瘫复发的原因之一，潜伏病毒的再激活与免疫力低下有关。干扰素可以有效降低单纯疱疹病毒性面瘫发生率和缩短面瘫持续时间；免疫球蛋白（IgG）不能有效降低面瘫发生率和缩短面瘫持续时间。     

Assessment of T Cell Activation in a Mouse Model of Traumatic Facial Nerve Injury

Objective To investigate T cell activation following facial nerve axotomization and latent neuroimmunologic mechanisms in traumatic facial paralysis. Methods A murine model of facial nerve transaction was used. Lymphocytes from cervical and mesenteric lymph nodes in BABL/c mice at specific times were collected and expression rates of CD69 on T cells were assessed by flow cytometry. Results Infiltrating T cells were detected around the facial neurons in the facial nerve nucleus in mice whose facial nerve was transected. Immunofluorescent staining showed recruitment of activated T cells. Three days post-facial nerve transection, the expression rate of CD69 on T cells from cervical draining lymphoid nodes (CDLNs) was significantly different from that on T cells from mesenteric lymph nodes (MLNs)(P=0.0457), whereas the latter was similar to that in animals undergoing sham surgeries and that in blank control animals (p=0.2817 and 0.2724, respectively). Two weeks post-nerve transection, the T cell CD69 expression rate from CDLNs remained at a higher level and than that in the sham-operation animals (p=0.0007). At two weeks, CD69 expression rate on T cells from MLNs was also up-regulated and different compared with the sham-operation animals and with itself at three days post-operation (p=0.0082 and 0.0133, respectively). Conclusion T cells appear to be activated and up-regulated in CDLNs following facial nerve transection. There is even evidence of T cell activation in MLNs at 2 weeks post-nerve transection. This suggestes an alteration of immune response from local to general immunity in the acute stage of facial nerve trauma, which may help coordinating and controlling the scales and orientation of the neuroimmune response during the pathogenesis and progression of facial nerve trauma.     

中耳乳突手术引起面神经损伤的修复与预后分析

目的 探讨分析中耳乳突手术导致医源性面神经损伤的原因、部位以及手术修复方法和预后效果.方法 选择中耳乳突手术后立即发生周围性面神经麻痹,并经再次手术探查、修复的42例医源性面神经损伤病例,按House-Brackmann法对面神经功能进行分级,根据探查时所见,分析发生面神经损伤的原因和部位;依据面神经损伤的部位和范围,分别采用面神经减压、吻合、耳大神经移植、面神经-舌下神经吻合术等进行修复治疗;对于随访1年以上、资料齐全的28例患者,根据手术前后面神经功能的分级进行比较,分析治疗效果和预后.结果 开放式乳突根治术是引起面神经意外损伤的最常见的中耳乳突手术,损伤部位以面神经鼓室段、锥段最多见.主要病理改变包括:面神经水肿9例(21.4％);面神经鞘膜损伤10例(23.8％);面神经纤维部分断裂4例(9.5％);面神经完全断裂17例(40.5％);未见明显病变2例(4.8％).面神经修复方法包括:面神经减压24例(57.1％),端-端吻合2例(4.8％),改道吻合2例(4.8％),耳大神经移植吻合10例(23.8％),面神经-舌下神经吻合4例(9.5％).随访1年以上,资料完整的28例患者预后与疗效分析:面神经减压17例,术前面神经功能Ⅳ级4例,Ⅴ级12例,Ⅵ级1例,术后1年面肌功能恢复至Ⅰ级4例,Ⅱ级11例,Ⅲ级2例;耳大神经移植5例,术前面神经功能均为Ⅴ级,术后恢复至Ⅱ级3例,Ⅲ级2例;面神经-舌下神经吻合4例,面神经功能从Ⅴ级恢复至Ⅲ级;改道和端-端吻合各1例,面神经功能均由V级恢复至Ⅱ级.结论 面神经鼓室段和锥段是中耳乳突手术时最容易损伤的部位;根据损伤程度和范围的不同,行面神经减压、吻合、耳大神经移植、面神经-舌下神经吻合术可以使患者获得较好的预后效果.     

小鼠病毒性面神经炎模型中面神经元凋亡的研究

目的 探讨1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）性面神经炎动物模型中面神经运动神经元（facial motor neurons,FMN）的凋亡情况以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。方法 Balb/c小鼠84只,分别进行HSV-1接种和面神经切断处理。在操作后第1、3、7、10、15、20及30天分批处死动物,对面神经核进行HE染色、尼氏染色;采用原位末端转移酶标记（terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL）技术检测FMN的凋亡;免疫组化染色检测凋亡相关基因bcl-2和bax在FMN中的表达。结果 面神经切断后,同侧FMN出现凋亡,在第10、15天达高峰,Bcl-2表达降低,Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降;接种病毒后,同侧FMN没有明显的细胞凋亡,Bcl-2表达增高,在第15天达高峰,Bcl-2/Bax比值上升。结论 小鼠面神经接种HSV-1后FMN没有明显凋亡,可能与神经损伤程度轻以及HSV-1抑制宿主细胞凋亡有关,Bcl-2、Bax可能参与调控FMN的凋亡。     

Vitamin D3 potentiates myelination and recovery after facial nerve injury

Roles of vitamin D on the immune and nervous systems are increasingly recognized. Two previous studies demonstrated that ergocalciferol (vitamin D2) or cholecalciferol (vitamin D3) induced functional recovery and increased myelination in a rat model of peroneal nerve transection. The current report assessed whether cholecalciferol was efficient in repairing transected rabbit facial nerves. Animals were randomized into two groups of rabbits with an unilateral facial nerve surgery: the vitamin D group included animals receiving a weekly oral bolus of vitamin D3 (200 IU/kg/day), from day 1 post-surgery; the control group included animals receiving a weekly oral bolus of vehicle (triglycerides). Contralateral unsectioned facial nerves from all experimental animals were used as controls for the histological study. The facial functional index was measured every week while the inner diameter of myelin sheath and the G ratio were quantified at the end of the 3 month experiment. The current report indicates that cholecalciferol significantly increases functional recovery and myelination, after 12 weeks of treatment. To the best of our knowledge, this is the first study investigating the therapeutic benefit of vitamin D supplementation in an animal model of facial paralysis. It paves further the way for clinical trials based on the administration of this steroid in individuals with injured facial nerves.     

Role of T-lymphocyte subsets in facial nerve paralysis owing to the reactivation of herpes simplex virus type 1

CONCLUSION: Although both T-cell subsets are essential for inhibiting HSV-1 reactivation in the GG, CD4 + T cells play a more important role in host defense against virus replication. OBJECTIVE: To elucidate the host immunological factors that participate in herpes simplex virus type 1 (HSV-1) reactivation in the geniculate ganglia (GG) and lead to facial paralysis, we developed a mouse model of facial paralysis that involved the reactivation of HSV-1 following general immune suppression. MATERIAL AND METHODS: Eight weeks after recovery from primary facial paralysis caused by inoculating the auricle with HSV-1 the auricle was scratched and mice (n = 69) were given an i.p. injection of either anti-CD4 (n = 46) or anti-CD8 (n = 23) monoclonal antibody to deplete specific T-lymphocyte subsets. Following this reactivation procedure, the rate of recurrent facial paralysis was compared between the two models. The GG were examined histopathologically and using polymerase chain reaction to detect HSV-1 DNA. RESULTS: Facial paralysis developed in 42% of mice in the anti-CD4 model and in 13% in the anti-CD8 model. HSV-1 DNA was detected in 50% of the mice in both models. Histopathologically, neurons were destroyed in parts of the GG and numerous virus particles were seen in the surviving neurons.