半套式PCR扩增人抗HFRS病毒抗体基因及Fd段基因的克隆？…

从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）中提取细胞总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ。以之为模板，用半套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增人ＩｇＧ抗体Ｆｄ段及轻链基因，并将Ｆｄ段基因克隆入噬菌体载体ｐｃｏｍｂ３；经酶切鉴定后，再亚克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ，筛选阳性克隆测序。经计算机分析，Ｆｄ段基因的全长为６３９ｂｐ，编码２１３个氨基酸，属于人ＩｇＧ２亚类。     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

抗胃癌鼠单抗3G9 Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌…

本文报道用聚合酶链延伸反应（ＰＣＲ）从分泌抗胃癌鼠单抗的杂交瘤细胞系３Ｇ９中克隆出了重链Ｆｄ段和ｋ链的基因。ＤＮＡ序列测定表明３Ｇ９的ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ７１８３、ＤＦＬ１６．１和ＪＨ３；Ｖｋ和Ｊｋ分别属于ＶｋⅡ和Ｊｋ２。将３Ｇ９Ｆｄ段和ｋ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３中，在大肠杆菌中获得了表达，用还原和非还原的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳作免疫印迹实验，证明了Ｆａｂ段的表达。并用酶联免过滤实     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。     

降钙素基因相关肽单克隆抗体的研制及初步鉴定

以人工合成的降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）－牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联物（ＣＧＲＰ－ＢＳＡ）为免疫原，用微量脾内免疫法免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取其免疫脾细胞与小鼠Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞融合，经间接ＥＬＩＳＡ法筛选、３次克隆化后，获得３株能稳定分泌抗ＣＧＲＰ单克隆抗体的杂交瘤细胞３Ｂ４、７Ｅ１１和８Ｆ２。用琼脂双扩散法鉴定，３Ｂ４为ＩｇＧｌ亚类，７Ｅ１１和８Ｆ２均为ＩｇＭ类。杂交瘤细胞的染色体条数在９２￣     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

人血小板／T细胞活化抗原PTA1／Ig融合蛋白表达载体的构建,表 …

目的；获得人血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）胞膜外区与人ＩｇＧ１Ｆｃ段融合蛋白。为ＰＴＡ１配体的鉴定及其功能的研究提供有力的工具，方法：针对ＰＴＡ１ｃＤＮＡ序列设计３段引物，通过反转录，半套式ＰＣＲ方法从活化Ｊｕｒｋａｔ细胞中扩增出ＰＴＡ１胞膜外区基因片段，并将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＩＧ中，通过酶切，ＰＣＲ及序列测定鉴定     

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ抗体的轻链和重链Ｆｄ段基因,分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＬＰＴＧ诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处３有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为５３％和４８。Ｌ链和Ｆｄ包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中,Ｌ和Ｆｄ可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。     

人─鼠抗人小细胞肺癌嵌合重链基因在小鼠骨髓瘤细胞中的表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法获得小鼠抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因（ｃＤＮＡ），构建成含人──鼠抗人小细胞肺癌嵌合重链基因质粒（ｐＳＶ＿２△Ｈｇｐｔ２Ｆ＿７Ｖ＿ＨＨｕγ＿３）ＤＮＡ通过电脉冲介导基因转移的方法，转染小鼠骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ，并经选择培养基筛选出含有构建质粒基因的克隆，进一步按ＥＬＩＳＡ方法测定细胞表面和培养上清液中嵌合重链抗体的表达效率，最终选出表达抗体效率较高的单克隆细胞株为５Ｃ＿２，１２Ｂ＿９，２９Ｃ＿６。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法检测证明，阳性克隆细胞总ＲＮＡ经电泳后在１８Ｓ附近处与鼠抗人小细胞肺癌单抗的重链变区ｃＤＮＡ探针有明显的阳性杂交带出现。细胞抽提蛋白经ＳＤＳ──ＰＡＧＥ电泳分离显示在正常人ＩｇＧ重链分子相当的位置有一清晰条带出现，分子量约为５８ＫＤ，免疫印迹方法同样检测出此条带特异他与兔抗人ＩｇＧ（重链特异）抗体反应，证实人──鼠抗人小细胞肺癌嵌合重链基因在小鼠骨髓癌细胞中表达成功。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

Isolation and amplification of human IgE Fd encoding mRNA from human peripheral blood lymphocytes.

In order to establish the feasibility of applying recombinatorial library technologies to investigate human in vivo IgE responses, and as a pre-requisite of recombinatorial library construction, we have attempted to determine workable peripheral blood sample volumes required for isolation of mRNA for polymerase chain reaction (PCR) amplification of human IgE Fd encoding sequences. Cells secreting chimeric human IgE monoclonal antibody specific for the hapten NIP were used to establish the conditions for specific amplification of C epsilon 1 domain and Fd encoding sequences, as determined by Southern hybridisation. Amplification of C epsilon 1 domain sequences could be achieved using as few as ten cultured cells as the source of RNA. Specific IgE+ B cell enrichment using immuno-magnetic particles prior to RNA extraction was, however, required to obtain amplification of IgE C epsilon 1 and Fd fragments from lymphocytes prepared from 40 ml human peripheral blood. IgG1+ B cell enrichment from similar samples was not required for detectable amplification of human C gamma 1 cDNA sequences. However, this procedure improved amplification efficiency. Optimisation of methods to separate specific B cell populations, or specific RNA/cDNA sequences, will facilitate in vitro generation of human IgE Fab fragments from peripheral blood.     

Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors

PROBLEM : Sperm immobilizing antibodies cause infertility mainly through complement dependent sperm immobilization. To analyze any effect of sperm immobilizing antibody on fertilization, we had already established cell lines that secrete IgM monoclonal antibody (MAb H6-3C4) and IgG monoclonal antibody (MAb EnBCMGS). The latter was a class-switched recombinant IgG antibody that shares the same variable region as MAb H6-3C4. The biological effects of the IgG antibody were also reported previously to eliminate sperm immobilizing or sperm agglutinating activities. However, the method of chemical digestion of IgG had some disadvantage to prepare the purified Fab fragment stably and in large quantities. This time we report a unique method to obtain the recombinant Fab fragments (Fab EnBCMGS) using polymerase chain reaction (PCR) and cDNA expression vectors. METHOD : Two kinds of PCR primers were designed to make a truncated heavy chain (Fd) gene of MAb EnBCMGS. The amplified Fd gene and light chain gene were ligated into cDNA expression vectors and then transfected into mammalian cells. RESULTS : Expression of the Fd gene and light chain gene were confirmed by Northern blotting. Secretion of the recombinant Fab fragment from mammalian cells was also confirmed by Western blotting. The Fab fragment showed biological activity as is expected by FACS analysis. CONCLUSION : This method enables the stable production of genuine Fab fragments of IgG in mammalian cells without any chemical treatment that may be time consuming and affect the quality of the Fab fragments.     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原（EsAg）作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定

目的构建和鉴定鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库。方法利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取脾,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增,将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒,构建噬菌体抗体库。结果经过四轮"吸附-洗脱-富集"的过程后获得了12株阳性克隆。挑取5株进行序列分析,并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较,得到了两株不同的抗体,并进行了初步鉴定。结论本研究为朊病毒病的研究奠定了基础。     

外周血B淋巴细胞半套式PCR法扩增人抗体基因

目的用半套式PCR法，以一组人抗体重链和轻链引物直接从人外周血淋巴细胞中扩增人全套抗体基因片段．方法从不同人群外周血淋巴细胞中提取总RNA，经反转录后，以免疫球蛋白信号肽序列引物和家族特异性免疫球蛋白可变区基因引物，进行半套式PCR扩增人全套抗体基因片段．结果采用不同的引物进行重链、轻链Kappa和Lambda链的半套式PCR扩增，均能获得相应大小的PCR产物，其结果扩增率达到100％．结论在建立抗体基因文库时，半套式PCR法能进一步丰富扩增的抗体基因的多样性，可弥补由于转化效率不高而降低抗体库多样性的不足．     

V-Region and Class Specific RT-PCR Amplification of Human Immunoglobulin Heavy and Light Chain Genes from B-Cell Lines

We have designed and tested primers that amplify complete human kappa and lambda light chain genes, and human Fd fragments from gamma, mu and alpha heavy chain genes. These primers were tested for efficiency and specificity on monoclonal sources of human immunoglobulin RNA, obtained from human B-cell lines of known immunoglobulin gene expression. Analysis of the sequences derived from these B-cells confirms the specificity of the PCR primers and the extent of somatic mutation seen in different B-cell malignancies supports existing concepts for differing aetiologies in the tumours concerned.     

从人外周血B淋巴细胞中应用PCR扩增人抗体基因

本文用常规ＰＣＲ法和半套式ＰＣＲ法，以一组人抗体重链和轻链引物，直接从人外周血淋巴细胞中扩增出抗体重链Ｆｄ基因和轻链基因。一些常规ＰＣＲ法不能直接扩增的人抗体基因，用半套式ＰＣＲ法扩增却得到了阳性结果。扩增的抗体基因的分子量与国内外同类报道一致。本文结果提示，在建立抗体基因文库时，半套式ＰＣＲ法能进一步丰富扩增的抗体基因的多样性     

cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达差异cDNA序列的初步研究

目的寻找鼻咽癌中差异性表达基因，包括与鼻咽癌发病相关的候选抑瘤基因。方法应用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ＲＤＡ），分离原代培养的正常人鼻咽上皮细胞与鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中差异表达的ｃＤＮＡ序列，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交被用来分析差异性表达产物的来源，最后，将这些序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，并用链终止法测序。结果在第４轮杂交及扩增反应后，获得４条差异性条带。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证明，这些差异性片段来自作为“检测”扩增子的正常人鼻咽上皮，在鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中不表达或表达降低。序列分析这些差异性片段的克隆，发现一些序列是与已知基因高度同源的基因，包括一些看家基因；另有一些基因则为新基因序列。结论鼻咽癌的发生是一个多基因参与的过程，所获得的差异性片段中，与之同源的一些已知基因具有抑瘤功能。