HBV阿德福韦酯耐药位点基因突变检测方法的建立

目的探究并评价Taqman锁核酸(Locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)在检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染患者阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药位点基因突变中的应用价值。方法通过基因测序筛选阳性样本,进而构建ADV重组质粒标准品、标准曲线等,以构建的重组质粒为标准品建立实时荧光定量PCR反应体系,评价其线性范围、扩增效率、灵敏度及重复性等指标。结果 rtA181V、rtN236T位点野生型和突变型重组质粒被成功构建;Taqman-LNA荧光PCR检测的线性范围为1×10~9/μl～1×10~2/μl;rtA181V、rtN236T位点野生型及突变型质粒标准品的扩增效率均高于75;rtA181V位点可稳定准确检测到最低为0.04%的突变比例,rtN236T位点可稳定准确检测出最低为0.05%的突变比例,则Taqman-LNA荧光PCR检测rtA181V和rtN236T位点临床标本的灵敏度分别为0.04%和0.05%;rtA181V、rtN236T位点野生型及突变型质粒标准品在高、中浓度中的变异系数均5%。结论 Taqman-LNA荧光PCR检测法线性范围广、扩增效率高、灵敏度高、重复性好,是一种快速、简便、灵敏的基因突变检测方法,在检测HBV感染患者ADV耐药位点基因突变中具有较高的应用价值和临床意义。     

建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

目的为HBV突变检测建立一种有效、快速、简捷的蝎子实时荧光PCR新方法。方法同时用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法对比:对157例HBV患者的血清的DNA进行HBV基因rtN236T突变检测,统计其符合率;通过对混有不同比例的HBV基因rtN236T突变核酸的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度。结果在157例HBV患者的血清样本中,蝎子实时荧光PCR新方法检测到rtN236T突变的有69例,而Sanger测序法检测的有68例,其符合率为98.6%;蝎子实时荧光PCR新方法能检测出混有5%突变的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论蝎子实时荧光PCR新方法能有效检测到HBV突变,且比Sanger测序法更为简单、快速、灵敏度高,适合临床应用。     

建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术

目的建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的"凸背"引物荧光PCR新技术。方法对比"凸背"引物荧光PCR新技术和Sanger测序法:通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D(GGT>GAT)质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病(AML)患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率。结果 "凸背"引物荧光PCR新技术能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,高于Sanger测序法的10%~20%。在97例AML患者的外周血的DNA中,"凸背"引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7%。结论 "凸背"引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现。     

EVAGreen实时荧光定量PCR检测类志贺邻单胞菌的方法建立

目的 建立实时荧光定量PCR快速检测类志贺邻单胞菌的方法.方法 以类志贺邻单胞菌23S rRNA基因为目标设计引物,使用EVAGreen染料建立实时荧光定量PCR方法并优化反应条件,构建重组质粒作为标准DNA,建立标准曲线;评估该方法的灵敏度、重复性和特异性,并将所建方法用于粪便模拟样品的检测,与常规培养法比较.结果 在反应体系为10μl,模板为1μl的条件下,该方法可测的最低拷贝数为2.18×101拷贝/体系;重组质粒标准建立的标准曲线具有较大的线性范围(108～102 copies/μl);批间差异小于5％,批内差异小于3％;特异性试验中类志贺邻单胞菌检测结果均为阳性,其他常见肠道致病菌、常见弧菌以及常见正常肠道菌均为阴性;粪便模拟样品前增菌处理后检测灵敏度为25 cfu/10 ml增菌液,检测结果和传统培养法相符.结论 成功建立EVAGreen实时荧光定量PCR方法,该方法的建立为类志贺邻单胞菌的检测提供了一种简便、快捷的途径,并可对样品中类志贺邻单胞菌进行快速定量检测.     

肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应标准质粒的构建

目的制备用于检测肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准质粒。方法设计针对沙门菌inv A基因的引物,扩增特异片段,转入质粒载体中构建重组质粒。将构建的重组质粒作为标准品,进行优化后的实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并考察该标准品灵敏性及稳定性。结果成功构建含有沙门菌inv A基因的质粒标准品,用其建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.9979),最低可以检出10拷贝/反应。该标准质粒经验证具有良好的稳定性。用该质粒标准品检测肉制品中的沙门菌,经2 h增菌后,可在7 h内完成对样品的检测。结论所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门菌,为考量实验质量提供参考依据。     

人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品的构建

目的:构建用于检测人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。方法:通过逆转录PCR扩增得到目的片段后连接至pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞。分别经PCR和测序验证重组质粒的正确性。分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作梯度稀释制得质粒标准品。10倍梯度稀释质粒标准品后进行实时荧光定量PCR分析。结果:人端粒酶催化亚基(hTERT)基因片段成功克隆至pMD18-T载体之中,重组质粒序列完全正确。实时荧光定量PCR分析10倍梯度稀释的质粒标准品所得标准曲线良好。结论:成功构建了人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。     

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的 针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法.方法 结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度.采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测.随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点.结果 多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省.结论 本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段.     

杭州地区89例肺腺癌患者EGFR、KRAS与BRAF突变状态分析

目的分析杭州地区肺腺癌患者中EGFR、KRAS与BRAF基因的突变情况,并探讨其在肺腺癌个体化诊断和治疗中的临床应用价值。方法采用实时荧光定量PCR法检测患者肿瘤组织中EGFR、KRAS与BRAF突变情况。结果 89例肺腺癌患者中有47例存在EGFR基因突变,突变率为52.8%,19外显子和21外显子分别占突变总数的42.6%(20/47)和57.4%(27/47),20外显子T790M突变1例。KRAS突变率为3.3%(3/89),未检出BRAF突变。女性患者EGFR基因突变率(77.5%)高于男性患者(26.5%),不吸烟患者突变率(64.9%)高于吸烟患者(31.3%),差异均有统计学意义(P0.05)。结论在使用靶向治疗药物之前,应检测EGFR、KRAS和BRAF等基因的突变情况,依据基因突变结果制定个性化治疗方案。     

WU多瘤病毒实时荧光聚合酶链检测方法的建立与应用

目的 建立快速、准确、特异的检测WU多瘤病毒的实时荧光聚合酶链反应方法.方法 根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理,以WU多瘤病毒VP2基因为靶序列,设计并合成引物和荧光探针;优化PCR反应条件,评价实时荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对394例临床样本进行检测.结果 成功建立了WU多瘤病毒的荧光定量PCR检测方法;该试验所建立的实时荧光PCR方法可准确、特异的检测WU多瘤病毒;该方法可定量检测1.0×100～1.0×107拷贝范嗣的WU多瘤病毒;检测的批间和批内的变异系数均<5.0%;394例患儿痰标本中共检测出3例人WU多瘤病毒阳性,阳性率为0.76%.结论 所建立的WU多瘤病毒荧光定量PCR法敏感性较高,重复性、特异性良好,适合于临床标本检测及大样本量筛查,可为临床诊断及流行病学研究奠定方法学基础.     

HBV耐药基因的实验研究

目的:利用多色荧光PCR技术,建立快速检测HBV耐药基因的方法,并与基因测序法进行对照研究。方法:建立2个反应体系,每个反应体系包含四个耐药位点。对新建的多色荧光PCR法进行灵敏度和特异性分析,并对42例临床收集的服药患者血清进行耐药检测。结果:构建了多色荧光PCR检测HBV耐药位点的体系,其特异性较好,分析灵敏度可达1×103copies/ml。42例样本中检测到YVDD 3例(占7.14%),YIDD 1例(占2.38%);1896变异7例,占总数的16.67%。其他位点未检测到耐药突变。结论:所构建的多色荧光PCR检测体系为临床医院提供快速、简便的HBV耐药位点突变检测手段,较基因测序法方便、快捷。     

焦磷酸测序与PCR产物直接测序在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性比较

目的 通过与PCR产物直接测序比较,评价焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的应用价值.方法 选取临床使用拉米夫定抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者,分别采用巢式PCR焦磷酸测序法与巢式PCR产物直接测序法检测拉米夫定相关耐药位点rtl80变异情况,比较两种方法的敏感性与特异性.结果 焦磷酸测序与PCR产物直接测序均能准确的检测出优势病毒株(占总群＞90％),焦磷酸测序中rt180M所占比例在90％～50％时,PCR产物直接测序法检出率下降至76.92％及50.00％;焦磷酸测序样本中rtl80M所占比例为50％～10％,PCR产物直接测序法对耐药基因的检出率降至15.38％～10.00％;准种(占总群＜10％)焦磷酸测序可以测出,但PCR产物直接测序法无法检测出.结论 焦磷酸测序的方法监测乙型肝炎病毒变异同PCR产物直接测序法相比,有更好的灵敏性,在抗病毒治疗过程中能够检测HBV准种及种群漂移,对于研究抗病毒疗效及耐药预测具有重要意义.     

重叠延伸PCR法构建β地中海贫血基因突变质粒标准品

目的:构建含β地中海贫血(简称β地贫)-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品。方法:以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR,OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法分别构建含-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒。结果:DNA测序表明:重组质粒1的确含β地贫-28(A>G)突变基因,β珠蛋白-28处的碱基已由A突变成G,其余序列与野生型完全相同;重组质粒2的确含IVS-2-654(C>T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相。成功实现了定点诱变。结论:分别成功地构建了含β地贫-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品,进一步为HRM技术检测β地贫基因突变方法的建立及该病其它基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础。     

定点诱变法构建β地中海贫血IVS-2-654(C>T)突变基因质粒

目的构建含β地中海贫血(简称β地贫)IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒。方法以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR(OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法构建含IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒。结果双向测序结果表明:重组质粒的确含β地贫IVS-2-654(C>T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相同,成功实现了定点诱变。结论成功地构建了含β地贫IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒,进一步为该病基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础;OE-PCR定点诱变法简便、经济,值得推广应用。     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒(探针熔解分析)的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical performance of a probe melting analysis ( PMA)-based real-time PCR detection kit in rapid detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods The specificity of the assay was evaluated by detecting 37 non-tuberculous mycobacteria (NTM) ,and the detection limit of the method was evaluated by genomic DNA of a standard strain H37Rv. Finally, 962 clinical isolates were analyzed with the PMA assay by detecting mutations in rifampin resistance-determining region (RRDR) of rpoB gene, and results were verified with DNA sequencing. Results Among 37 NTM strains,three strains showed drug resistant mutation signals. The PMA method could detect down to 30 bacteria per reaction. Sample analysis showed that 186 of 962 isolates were mutants,751 isolates were wild type and 25 isolates failed to give amplification signals. Among the mutant samples detected, 112 samples from November 2009 to April 2010 were further analyzed by sequencing, as well as 200 wild-type samples. The results showed a complete agreement with the PMA assay except for 5 samples failed in sequence analysis. Conclusion The PMA assay is rapid, accurate and easy-to-use, and thus can be used for detection of rifampin-resistant in clinical isolate samples.     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

胃癌微卫星不稳定和KRAS基因突变与肿瘤免疫微环境的关系

目的 检测胃癌患者微卫星不稳定(MSI)和KRAS基因突变状态,探讨两者相互关系及对肿瘤免疫微环境的影响。方法 收集胃癌90例,采用多重荧光PCR法检测MSI,ARMS-PCR法检测KRAS基因第2号外显子突变,通过流式细胞分析术检测部分胃癌术后标本TILs CD8和PD-1表达水平。结果 MSI在胃癌中总发生率43.3%,KRAS基因突变率为8.89%,两者均在性别、年龄、肿瘤分期方面差异无统计学意义(P>0.05),两者之间不存在明显相关性(r=-0.037)。在不同MSI状态或KRAS基因突变背景下,胃癌组织TILs中CD8表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。KRAS基因突变与PD-1表达水平无明显相关性(P>0.05)。MSI-H组PD-1表达水平显著高于MSI-L组和MSS组(P<0.01)。结论 MSI发生和KRAS基因突变是胃癌形成过程中的相对独立事件,MSI-H表达的胃癌患者可能受益于肿瘤免疫治疗。     

HBV cccDNA SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种稳定、特异、敏感的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA (cccDNA) SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.方法 根据乙肝病毒松弛环状DNA (HBVrcDNA)与cccDNA的结构差异,设计跨越双缺口的特殊引物,并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP dependent DNase,PSAD)提高反应的特异性;建立荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性检验.应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA的抑制效果.结果 该方法能特异性检测到HBV cccDNA,在2.68×1082.68×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为-1.00,扩增效率为102％;最低检测限为2.68×101 copies/μl.拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA均有很好的抑制效果.结论 该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高,可快速定量检测HBVcccDNA,用于抗HBV药物的评价.     

循环肿瘤DNA与转移性结直肠癌靶向治疗及耐药机制的相关研究

目的 探讨转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)耐药相关的点突变,明确循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)能否作为mCRC检测和耐药相关的突变分子标志物以及mCRC可能的耐药机制。 方法 通过对连续抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)单抗药物治疗的mCRC患者多阶段ctDNA进行KRAS、BRAF和PIK3CA基因点突变动态监测,构建药物作用下的肿瘤基因突变谱变化,筛选耐药相关点突变;培养相应点突变细胞系后,通过体外细胞增殖试验(MTS法)分析细胞系的耐药程度,实时荧光定量PCR( real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测药物作用对突变丰度的影响。 结果 通过临床数据分析,筛选出可能与mCRC耐药相关的点突变KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E),并纳入后续研究。选择NCI-H747、SW948和SW1417细胞系分别作为KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)点突变的细胞系,并选用C2BBe1野生型细胞系作为本底细胞。MTS半数抑制浓度即IC₅₀测定发现,野生型细胞系对西妥昔单抗和帕尼单抗敏感性均较突变细胞高;经与本底细胞稀释后,西妥昔单抗组和帕尼单抗组在培养3 d后突变基因相对水平均比不加药组高,不加药组均比基线组高。 结论 ctDNA检测能够发现与耐药相关的点突变;KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)点突变可提高转移性结直肠癌细胞生长速度,并与西妥昔单抗和帕尼单抗耐药相关。