轻度修饰低密度脂蛋白诱导内皮细胞基因差异的表达

背景研究表明,轻度修饰低密度脂蛋白与动脉粥样硬化的形成有关,除了具有蓄积低密度脂蛋白作用外还有很强的生物学活性,可在培养细胞及动物体内诱导巨噬细胞集落刺激因子等多种生物活性物质的表达.目的采用差异显示-聚合酶链反应技术研究轻度修饰低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞的基因表达差异,为进一步阐明轻度修饰低密度脂蛋白与动脉粥样硬化的关系奠定基础.设计重复测量设计.单位泰山医学院.材料实验于2003-07/2004-07在泰山医学院基础研究所完成.人脐静脉内皮细胞培养基为M199,在37℃,50 mL/L的CO2条件下培养.细胞生长到融合状态时,培养基中加入轻度修饰低密度脂蛋白,至终浓度为400mg/L,诱导处理30 h.方法用差异显示反转录-聚合酶链反应技术分析轻度修饰低密度脂蛋白诱导下人血管内皮细胞的基因表达差异,并用反向Northern分析证实差异显示基因片段.主要观察指标①内皮细胞mRNA的差异显示分析.②差异片段的克隆、序列分析及同源性比较.③诱导与非诱导小鼠肝脏mRNA的反向Northern分析.结果轻度修饰低密度脂蛋白诱导下人血管内皮细胞出现一些上调和下调的基因片段.上调基因有胸腺素β4、FGFRI原癌基因伴随蛋白、FK506结合蛋白、rTSβ蛋白和细胞间粘附分子1;下调的基因有Apobec-1结合蛋白1、细胞色素B561和ERP72.结论用差异显示反转录-聚合酶链反应方法证实在体外轻度修饰低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞一些基因的表达水平变化,引起轻度修饰低密度脂蛋白血管内皮细胞发生病理变化,最终导致动脉粥样硬化斑块的形成.     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的：构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒，为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军第三О二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP—C1-hTERT，筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①聚合酶链反应扩增目的基因：电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3．5kb处有特异性目的条带，绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建和鉴定结果：双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果：荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论：①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建成功，为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法，并为建立永生化人肝细胞系奠定基础．     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法：实验于2005-03／2005—10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3．1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点，将其分别定向连人真核双表达载体pIPES，构建同时表达两个目的基因的双顺反子，通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果：①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定：将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoⅠ／MluⅠ和Xba Ⅰ／NotⅠ双酶切，经10g／L琼脂糖凝胶电泳可见1．2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达：以转染pIPES空质粒为阴性对照，48h后提取转染细胞的RNA分别用P1，P2和P3，P4作为引物进行反转录一聚合酶链反应。结果表明转染pIPES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1．2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA。结论：成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒，为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础。     

构建人热休克蛋白22基因真核表达载体pEGFP-N1/HSP22及在血管内皮细胞中的表达

背景:已有实验证实,人热休克蛋白22(Heat shock protein22,HSP22)存在于人的多种组织中,但构建其真核表达质粒是否可转染人血管内皮细胞并完整表达.目的:构建pEGFP-N1/HSP22真核表达质粒并观察在内皮细胞中的表达.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-03/10在南昌大学第二附属医院分子中心完成.材料:pEGFP-N1真核表达质粒及DH5α为南昌大学第二附属医院分子中心保存,MCF-7细胞来源于南昌大学生化实验室馈赠,人脐静脉血管内皮细胞(HUvEC)株购至南京基凯牛物技术公司.方法:采用反转录聚合酶链式反应从人MCF-7细胞中扩增热休克蛋白22基凶,将热休克蛋白22基因连接到真核表达载体pEGFP-N1中,并转化DH5α,获得阳性克降进行双酶切和测序鉴定.用脂质体法将重组质粒转染人脐静脉血管内皮细胞.主要观察指标:荧光显微镜、反转录一聚合酶链反应法及Western blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达.结果:①琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链反应扩增产物,热休克蛋白22基因片段长约613 bp,与预期分子量相符,测序结果证实克隆完全正确:其阳性克隆进行酶切鉴定与热休克蛋白22理论值相符.②反转录-聚合酶链反应法检测转染的人脐静脉血管内皮细胞中有热休克蛋白22mRNA表达;Western blot检测可见一特异性热休克蛋白22蛋白条带存在.结论:成功构建了携带人热休克蛋白22及pEGFP-N1真核表达质粒.并验证已在人脐静脉血管内皮细胞中表达.     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoI/MluI和XbaI/NotI双酶切,经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应。结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA。结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达与氧化型低密度脂蛋白的关系

目的:新近研究发现血管紧张素转化酶2与血管紧张素转化酶在功能上相拮抗.采用反转录-聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹方法,观察氧化型低密度脂蛋白对人血管内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响.方法:实验于2007-05/08在南方医科大学附属珠江医院中心实验室完成.①用正常人新鲜血浆制备氧化低密度脂蛋白,人脐静脉内皮细胞株复苏、传代后取生长良好的3～6代用于实验.②实验分为7组:空白对照组加无血清培养基;20,40,80mg/L氧化型低密度脂蛋白组分别与人脐静脉内皮细胞孵育24h;40mg/L氧化型低密度脂蛋白分别与人脐静脉内皮细胞孵育6,12,24h.各组实验重复6次.③提取细胞总RNA及蛋白,应用反转录-聚合酶链反应检测血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2mRNA表达水平;以蛋白质免疫印迹法检测血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2蛋白表达水平.结果:①与空白对照组比较,氧化低密度脂蛋白20,40,80mg/L组血管紧张素转化酶mRNA表达增加,血管紧张素转化酶2mRNA表达降低(P＜0.01),不同剂量组间差异亦有显著性意义(P均＜0.01).40mg/L氧化型低密度脂蛋白6,12,24h组血管紧张素转化酶mRNA表达增加,血管紧张素转化酶2mRNA表达减少(P＜0.05),不同时间点间差异亦有显著性意义(P均＜0.05).②与空白对照组比较,氧化低密度脂蛋白20,40,80mg/L组血管紧张素转化酶蛋白表达增加,血管紧张素转化酶2蛋白表达减少(P＜0.01),不同剂量组间差异亦有显著性意义(P均＜0.01).40mg/L氧化型低密度脂蛋白6,12,24h组血管紧张素转化酶蛋白表达增加,血管紧张素转化酶2蛋白表达降低(P＜0.05),不同时间点间差异亦有显著性意义(P均＜0.05).结论:氧化型低密度脂蛋白可上调血管紧张素转化酶蛋白及基因表达,下调血管紧张素转化酶2蛋白及基因表达,且呈剂量和时间依赖性.