二甲双胍对人食管鳞癌侧群细胞的作用及机制

 目的 探讨二甲双胍（metformin, Metf）对人食管鳞癌侧群（side population, SP）细胞的作用及机制。方法 通过流式细胞仪检测食管鳞癌细胞系SP比例及分选SP细胞，CCK-8法、平板克隆及成球实验检测Metf对SP细胞体外增殖的影响，Western blot法检测Metf对SP细胞相关基因蛋白表达的影响。结果 本实验中的9种食管鳞癌细胞系的SP比例在0.2%~2%左右。Metf能够降低KYSE 150 SP比例、明显抑制SP细胞的细胞增殖、克隆形成数和成球生长数，其抑制程度与Metf浓度及给药时间呈显著正相关性，差异有统计学意义（P<0.01）。此外，Metf能不同程度地降低SP细胞中相关“干性”基因SOX2与OCT4的表达。结论 Metf 能抑制食管癌细胞中SP细胞，可能为食管癌治疗与预防提供新的途径。     

RNA干扰沉默IQGAP1表达可提高食管鳞癌细胞KYSE150对顺铂的化疗敏感度北大核心CSCD

目的研究具有IQ结构域的GTP激酶活化蛋白1基因(IQGAP1)对食管癌细胞KYSE150化疗敏感度的影响及其相关作用机制。方法构建针对IQGAP1基因的小干扰RNA(si RNA)并转染至食管鳞癌细胞株KYSE150,采用MTT法观察KYSE150细胞对化疗药物顺铂敏感度的改变;流式细胞技术检测IQGAP1基因沉默前后顺铂对KYSE150细胞周期分布及凋亡的影响;Western blot检测细胞转染前后转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)和多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达水平变化。结果转染si RNA可显著下调KYSE150细胞中的IQGAP1 m RNA和蛋白表达水平;经(1、5、10、20)μmol/L顺铂处理细胞24 h后,干扰组(IQGAP1-si RNA)的细胞生存率均较对照组发生明显下降(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示干扰组在顺铂处理后G_0/G_1期细胞比例和凋亡率均明显高于对照组(P<0.05);Western blot结果显示IQGAP1基因沉默后,Nrf2和MRP1蛋白表达下调。结论沉默IQGAP1基因可有效提高人食管鳞癌细胞株KYSE150对顺铂的化疗敏感度,该作用可能是通过下调Nrf2和MRP-1蛋白表达来实现的。     

尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用

目的:比较选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用。方法:选取食管鳞癌细胞株EC 109、KYSE 150和TE-1,采用Western blot方法测定COX-2蛋白表达、MTT法检测细胞增殖抑制,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,观察尼美舒利对各组细胞的增殖抑制和促凋亡作用。结果:COX-2蛋白在EC 109细胞中呈高表达,KYSE 150细胞中呈中等度表达,TE-1细胞不表达COX-2蛋白。尼美舒利在50μmol/L-400μmol/L浓度区间可抑制EC 109、KYSE 150细胞的增殖(P<0.05),并呈剂量依赖性,在400μmol/L时对TE-1细胞有抑制作用。EC 109细胞尼美舒利的IC50值最低,KYSE150次之,TE-1最高。尼美舒利可使EC 109和KYSE 150的细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,但对TE-1细胞无上述作用。结论:尼美舒利对表达COX-2的食管鳞癌细胞有较好的增殖抑制和促凋亡作用。     

尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用

目的：比较选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用。方法：选取食管鳞癌细胞株EC 109、KYSE 150和TE-1,采用Western blot方法测定COX-2蛋白表达、MTT法检测细胞增殖抑制,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,观察尼美舒利对各组细胞的增殖抑制和促凋亡作用。结果：COX-2蛋白在EC 109细胞中呈高表达,KYSE 150细胞中呈中等度表达,TE-1细胞不表达COX-2蛋白。尼美舒利在50μmol/L-400μmol/L浓度区间可抑制EC 109、KYSE 150细胞的增殖（P〈0.05）,并呈剂量依赖性,在400μmol/L时对TE-1细胞有抑制作用。EC 109细胞尼美舒利的IC50值最低,KYSE150次之,TE-1最高。尼美舒利可使EC 109和KYSE 150的细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,但对TE-1细胞无上述作用。结论：尼美舒利对表达COX-2的食管鳞癌细胞有较好的增殖抑制和促凋亡作用。     

经典Wnt通路与食管癌细胞放射抵抗相关关系探讨

目的 明确经典Wnt通路在食管癌细胞放射抵抗中的作用,探讨经典Wnt通路介导食管癌细胞放射抵抗的机制,为临床上增强食管癌放射敏感性提供重要的分子靶点。方法 应用克隆形成实验检测人食管癌细胞EC9706、ECA109、KYSE70、KYSE150的放射敏感性。通过蛋白质印迹和RT-PCR检测照射后经典Wnt通路的活化情况。通过添加经典Wnt通路激活剂(AZD2858)和抑制剂(XAV-939)综合评价经典Wnt通路对食管癌细胞放射敏感性的影响。通过细胞免疫荧光技术检测照射后细胞DNA双链断裂(DSB)的产生、修复和DNA双链断裂修复蛋白焦点的形成。结果 4种食管癌细胞的放射敏感性由高到低分别为EC9706、ECA109、KYSE70、KYSE150细胞。KYSE150细胞照射后细胞核内β联蛋白增加,c-Myc基因转录上调(均 P<0.05);而EC9706细胞照射后细胞核内β联蛋白、c-Myc基因转录与照射前相近(均 P>0.05)。EC9706细胞经AZD2858处理后放射抗性增加(P<0.05),而KYSE150细胞经XAV-939处理后放射抗性降低(P<0.05)。AZD2858使EC9706细胞DNA双链断裂修复加快(P<0.05),而XAV-939使KYSE150细胞DNA双链断裂修复减慢(P<0.05);XAV-939通过抑制同源重组修复相关蛋白(BRCA1和RAD51),而不是非同源末端连接修复相关蛋白(Ku80和XRCC4)降低DNA双链断裂修复能力。结论 经典Wnt通路通过调控照射后DNA双链断裂的同源重组修复参与对食管癌细胞放射敏感性的调控,抑制经典Wnt通路可以克服食管癌细胞的放射抵抗,增强放射对食管癌细胞的杀伤作用。     

p62蛋白在食管鳞癌细胞中核浆易位的机制研究

目的：探讨p62蛋白在食管鳞癌细胞中核浆易位的影响因素及其可能机制。方法：采用核输出抑制剂KPT330处理食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE150和KYSE510后，利用免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜分别观察抑制剂处理前后食管鳞癌细胞中p62蛋白的定位情况。利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）磷酸化蛋白质组技术鉴定食管鳞癌细胞中p62蛋白的磷酸化位点。定点突变技术用于构建p62不同磷酸化状态的突变体。通过免疫共沉淀实验（Co-IP）、邻位连接实验（PLA）分析p62与GSK-3β的相互作用情况。结果：使用核输出抑制处理后，免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察发现，p62积聚在细胞核中。质谱鉴定结果显示，食管鳞癌细胞中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332这4个位点的磷酸化，进一步发现T269/S272位点磷酸化、且同时S328/S332去磷酸化可使胞浆中的p62转移至细胞核中。Co-IP和PLA实验结果显示，p62与GSK-3β存在直接的相互作用。结论：食管鳞癌细胞中p62的核浆易位与其S328/S332磷酸化状态相关，且可能受GSK-3β激酶调控。     

MAD2基因沉默促进人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的实验研究

背景与目的:有丝分裂检测点缺陷可引起细胞染色体不稳定性而使细胞生物学行为改变,本实验探讨RNA干扰有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)基因表达对人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:利用脂质体转染的方法,将MAD2基因的siRNA转染食管鳞癌细胞KYSE30,并通过RT-PCR以及免疫印迹的方法进行siRNA效果鉴定.实验分为正常对照组、非特异干扰组、特异干扰组.MTT、克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,损伤刮擦实验和Transwell小室实验分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力.结果:siRNA作用48 h组,MAD2蛋白的表达最低;相应地,迁移黏附能力增强,侵袭实验显示转染后细胞侵袭能力较转染前有显著加强.结论:MA4D2基因沉默能够促进人食管鳞癌细胞系KYSE30的体外增殖和侵袭能力增强,并抑制凋亡,提示其变化对肿瘤的发生和转移发挥重要作用.     

异甘草素抗食管癌细胞活性及其机制研究

目的:探讨中药单体异甘草素（isoliquiritigenin,ISL）对人食管鳞癌细胞系EC9706和KYSE450的影响及其作用机制。方法:利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测ISL对上述2株人食管鳞癌细胞系的细胞毒性;流式细胞术分析ISL对细胞周期及凋亡的影响;Western-blotting技术分析IGF1/IGF-1R信号通路相关蛋白表达以了解ISL的可能作用机制。结果:MTT实验结果表明,ISL以剂量依赖性的方式抑制食管鳞癌细胞EC9706和KYSE450的增殖,IC50值分别为 25.56 μmol/L和27.78 μmol/L。此外,ISL可将2株细胞周期阻滞在G2/M期及以剂量依赖性的方式诱导细胞发生凋亡,并且显著下调IGF-1R表达及抑制其下游PI3K/AKT和RAS/MAPK信号通路的激活。结论:ISL具有很强的抗食管癌活性,其作用机制与其调节细胞周期和促使细胞凋亡有关。本研究首次证明中药单体ISL具有抗食管癌活性,为临床运用中药治疗食管癌提供了新思路。     

敲低膜联蛋白A2对食管鳞癌细胞恶性表型的抑制作用

目的：利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲低膜联蛋白A2(ANXA2)基因的食管鳞癌细胞,研究该基因对食管鳞癌细胞表型的影响。方法：在公共数据库中查找ANXA2基因及对照的向导RNA(gRNA),选取6个ANXA2 gRNA及1个对照g RNA,使用CRISPR/Cas9载体构建表达ANXA2 gRNA的重组质粒,转入HEK293FT细胞制备gRNA/Cas9慢病毒,将慢病毒感染食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞后,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞并扩大培养。采用Western blot检测ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白的表达情况,逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ANXA2 mRNA表达情况,Transwell和集落形成实验分别检测细胞迁移侵袭和集落形成能力的变化。结果：成功构建了CRISPR/Cas9质粒;Sanger测序结果表明,ANXA2基因敲低质粒及对照质粒均构建成功。与对照组比较,病毒感染细胞后,Western blot结果显示,其中两个gRNA靶点病毒感染的KYSE30细胞中ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白水平均显著降低(P<0.05);同时RT-q...     

敲降Ras相关结合蛋白23表达对食管鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移的影响及机制

目的探讨Ras相关结合蛋白23(RAB23)在食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)细胞侵袭和迁移中的作用和机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测16例配对食管鳞癌及癌旁正常组织中RAB23 mRNA的表达。比较基因表达综合(GEO)数据库的GSE20347数据集中食管鳞癌和配对癌旁正常组织RAB23 mRNA的表达水平。免疫组织化学检测106例配对食管鳞癌和癌旁正常组织、33例淋巴结阳性与10例淋巴结阴性患者原发灶与淋巴结组织中RAB23蛋白含量。在食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞中瞬时敲降RAB23表达(转染si-RAB23-1和si-RAB23-9)或者稳定敲降RAB23表达(转染sh-RAB23), 采用Western blot法验证RAB23敲降效率, 采用细胞计数试剂盒8法和裸鼠皮下成瘤实验检测食管鳞癌细胞的增殖能力, 采用Transwell实验和裸鼠尾静脉-肺转移实验检测食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力, 采用细胞黏附实验检测食管鳞癌细胞的黏附能力, 采用转录组测序技术分析RAB23敲降后对细胞转录谱的影响, 并通过Western blot检测验证相关信号通路。结果 16...     

LETM2在食管鳞癌中的表达及其作用

  目的  探讨LETM2在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的表达,研究LETM2对ESCC细胞系KYSE150和ECA109增殖和侵袭迁移的影响。  方法  免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测90例ESCC及癌旁组织LETM2蛋白表达差异,RT-PCR和Western blot检测ESCC细胞系LETM2表达情况,慢病毒敲低KYSE150和ECA109细胞中LETM2表达。MTT和克隆形成技术检测LETM2对ESCC细胞增殖和克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell法分析LETM2敲低后细胞迁移侵袭能力的差异。  结果  在ESCC组织中LETM2的表达显著高于癌旁组织,LETM2通过抑制ESCC细胞G₁期向S期转化进而抑制细胞增殖,但对侵袭和迁移能力影响不大。  结论  LETM2可能作为驱动基因促进ESCC的发生发展,是ESCC的关键遗传变异,可能作为ESCC早诊早治的分子标志物。      

NCOR2 基因通过调控PI3K/AKT 通路促进食管鳞状细胞癌KYSE450细胞迁移和侵袭

目的：探究核受体辅阻遏物2(NCOR2)基因对食管鳞状细胞癌（ESCC）发生发展的影响及其潜在的分子调控机制。方法:收集2017年5月至2018年7月间在山西省肿瘤医院确诊的155例ESCC患者的癌及癌旁组织标本及临床资料,利用患者的转录组和临床病理数据进行生存预后分析及临床关联性分析。采用qPCR法检测6种ESCC细胞（TE-1、TE-5、TE-9、KYSE150、KYSE180和KYSE450）中NCOR2基因的表达水平,筛选NCOR2基因高表达的KYSE450细胞进行siRNA敲低实验,构建敲降NCOR2的细胞模型。利用CCK-8、克隆形成、细胞划痕和Transwell实验检测敲低NCOR2对KYSE450细胞增殖活性、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。对NCOR2敲低的KYSE450细胞进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,进行GO和KEGG富集分析,解析NCOR2可能影响的信号调控网络。结果：NCOR2在ESCC组织中表达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）,NCOR2高表达ESCC患者的预后较差（P<0.05）。敲低NCOR2基因表达后,KYSE450细胞划痕愈合...     

EZH2和H3K27me3的表达对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:通过转染Zeste同源物增强子2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)过表达或者敲低载体,探讨EZH2和Lys27位点三甲基化组蛋白H3(histone H3 methylated Lys27,H3K27me3)对食管麟状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:应用实时荧光定量PCR、Western blotting法检测ESCC细胞株KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109中EZH2 mRNA水平,以及ESCC细胞过表达或者敲低EZH2对H3 K27me3表达水平的影响.用划痕实验及Transwell侵袭实验分析过表达或者敲低EZH2后ESCC细胞的迁移侵袭能力.用实时荧光定量PCR法分析ESCC细胞过表达及敲低EZH2对MMPs mRNA水平的影响.结果:食管癌Eea109及TE1细胞中EZH2和H3K27me3 mRNA和蛋白水平明显高于KYSE30及KYSE170细胞(P＜0.05).过表达EZH2的食管癌KYSE30及KYSE170细胞H3K27me3蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05),敲低EZH2后Eca109及TE1细胞H3 K27 me3蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05).过表达EZH2后,KYSE30及KYSE170细胞的穿膜数目明显增多[(281.33±4.10)、(241.67 ±4.04) vs(132.00 ±4.00)、(105.33 ±3.51)个,均P＜0.05]、迁移距离明显增大[(63.6±1.2)、(62.5±2.5)vs (23.0±2.3)、(21.2±1.0) μm,P＜0.05].敲低EZH2后Eca109及TE1细胞的穿膜数目显著减少(均P＜0.05),转染shEZH2后Eca109及TE1细胞迁移的距离明显减小(均P＜0.05).结论:EZH2可增加靶基因启动子上组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化,并增强ESCC细胞的迁移和侵袭能力.     

circ_0000619通过调控miR-595/GLS轴对食管鳞状细胞癌细胞增殖及谷氨酰胺代谢的影响

目的:探讨circ_0000619/miR-595/GLS轴对人食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）KYSE150细胞增殖、迁移、侵袭和谷氨酰胺代谢的影响及其可能的机制。方法:采用qPCR法检测KYSE150细胞中circ_0000619、miR-595、谷氨酰胺酶（glutaminase,GLS）mRNA等表达水平,Western blot检测KYSE150细胞中GLS蛋白的表达情况,使用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）试剂盒、Transwell法分别检测KYSE150细胞增殖、迁移及侵袭能力,使用相应的检测试剂盒检测KYSE150细胞谷氨酰胺消耗、谷氨酸产生及ATP产生水平,利用生物信息学分析技术及双荧光素酶报告基因实验分析并检测circ_0000619、miR-595与GLS mRNA之间的相互作用关系。结果:circ_0000619在ESCC细胞系中呈现高表达,其亲本基因DENND4A mRNA在食管癌组织中呈高表达（P<0.01）;敲减circ_0000619显著抑制KYSE150细胞的增殖、侵袭和迁移能力（P<0.01）,并显著抑制KYSE150细胞的谷氨酰胺消耗、谷氨酸及ATP产生水平（P<0.01）;敲减circ_0000619显著上调miR-595表达（P<0.01）,抑制GLS mRNA（P<0.01）及蛋白的表达;双荧光素酶报告基因实验显示在KYSE150细胞中,circ_0000619与miR-595存在靶向结合、miR-595与GLS存在靶向结合（P<0.01）。circ_0000619敲低显著降低了KYSE150细胞谷氨酰胺代谢和细胞增殖,并且这些作用被miR-595抑制或GLS过表达部分逆转。结论:circ_0000619能通过靶向调控miR-595/GLS轴增强ESCC细胞谷氨酰胺代谢及细胞增殖,并可能成为潜在的ESCC治疗靶点。     

SLP-2基因反义核酸对食管鳞癌细胞系TE12生长和增殖的影响

背景与目的应用cDNA微阵列从食管鳞癌配对组织中得到一批在食管鳞癌中差异表达的基因,其中包括SLP-2(stomatin-likeprotein2,SLP-2),它在食管鳞癌中高表达。为验证SLP-2在食管鳞癌中的高表达,构建SLP鄄2真核表达载体,以探讨SLP鄄2与食管鳞癌发生、发展的关系。方法利用PCR从正常食管上皮cDNA中扩增SLP-2的开放阅读框,将SLP-2重组到pcDNA3.1/myc-His(-)中,构建SLP鄄2的真核表达质粒。然后将重组子导入食管鳞癌细胞系TE12中。半定量RT鄄PCR鉴定转染细胞,获得阳性细胞克隆。采用MTT比色法、平板克隆形成实验、流式细胞术和MTS比色法分析SLP鄄2对TE12细胞的影响。结果SLP鄄2在食管鳞癌中高表达。SLP鄄2基因反义转染抑制TE12细胞SLP鄄2表达时,可抑制细胞生长和增殖,导致S期阻滞,并抑制TE12细胞的粘附功能。结论食管鳞癌中SLP鄄2表达上调促进TE12细胞过度生长和增殖,并参与食管鳞癌的转移。