IGFBP2、IGFBP6在TGF-β1活化的肝星状细胞中表达

目的： 观察胰岛素样生长因子结合蛋白2、6（IGFBP2、IGFBP6）在转化生长因子β₁（TGF-β₁）诱导活化后的肝星状细胞中的表达变化。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）、不同浓度的TGF-β₁ 处理组，处理因素作用24 h，采用免疫细胞化学染色、Western blotting检测IGFBP2、IGFBP6在HSC-T6中的表达。结果：免疫细胞化学染色及Western blotting结果发现，TGF-β₁各处理组IGFBP2、IGFBP6的表达均较空白对照组显著增强。结论：IGFBP2、IGFBP6在TGF-β₁诱导活化后的HSC-T6中表达明显增强，IGFBP2、IGFBP 6可能参与了肝纤维化的形成。     

IGFBP-rP1对肝星状细胞活化及核因子-KB活性的影响

目的:明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)是否具有活化肝星状细胞(HSC)、增加细胞外基质(ECM)合成的作用;并探讨可能的信号转导途径.方法:大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)体外培养,分别设立空白对照组(加入等量PBS)和不同浓度的IGFBP-rPl处理组,干预因素处理24 h后收集细胞爬片或制备单细胞悬液,采用免疫细胞化学染色观察HSC-T6中Ot-平滑肌肌动蛋白(、I型胶原(colla-gen I)、纤维连接蛋白(FN)的表达变化;流式细胞仪检测HSC-T6中核因子-KB v65(NF-KB p65)的DNA结合活性.结果:免疫细胞化学染色结果发现,IGFBP-rPl各处理组、collagen I、FN的表达均较空白对照组显著增强,且在一定范围内呈剂量依赖关系;流式细胞仪检测结果显示,IGFBP-rPl各处理组NF-KB p65阳性细胞百分数均较空白对照组明显增高.结论:IGFBP-rPl可以激活HSC,且在一定剂量范围内随着IGFBP-rPl剂量的增加HSC活化的程度逐渐增强;IGFBP-rPl可使ECM的重要组成成分collagen l和FN的合成增加;IGFBP-rPl可增强HSC中NF-KB p65的DNA结合活性.     

大鼠肝纤维化与microRNA-181a调控肝星状细胞自噬的关系

目的:观察四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化(HF)大鼠肝脏结构的改变、肝组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、微小RNA-181a(microRNA-181a)、自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/-Ⅰ和beclin-1水平及胶原沉积的变化,以及microRNA-181a对TGF-β1诱导大鼠肝星状细胞(HSCs)自噬的作用,探讨microRNA-181a调控HSCs活化及HF的可能机制。方法:(1)40只健康雄性Wistar大鼠随机分为空白对照(control)组和CCl4诱导HF模型2周(W2)、4周(W4)、6周(W6)及8周(W8)组,每组8只。control组给予皮下注射橄榄油3 mL/kg;W2、W4、W6及W8组给予皮下注射40%CCl4(4∶6混合橄榄油)3 mL/kg,每周2次,分别连续作用2、4、6及8周;Masson染色评估大鼠HF改变;ELISA法检测大鼠血清及肝组织中TGF-β1的水平;RT-qPCR检测肝组织中microRNA-181a的表达;Western blot检测肝组织中LC3-Ⅱ/-Ⅰ、beclin-1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原(ColⅢ)的蛋白水平;(2)microRNA-181a inhibitor转染大鼠HSC-T6细胞,或采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理细胞后,以TGF-β1诱导细胞自噬,RT-qPCR和Western blot分别检测HSC-T6细胞中microRNA-181a的表达及LC3-Ⅱ/-Ⅰ、beclin-1、α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ的蛋白水平。结果:(1)大鼠肝组织中TGF-β1和micro RNA-181a表达、自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/-Ⅰ比值和beclin-1水平均随HF程度加重而呈上升趋势,microRNA-181a表达水平与细胞自噬呈正相关(P<0.01);(2)体外TGF-β1诱导HSC-T6细胞自噬及活化时伴有microRNA-181a表达显著上调;转染microRNA-181a inhibitor后HSC-T6细胞中microRNA-181a表达显著下降,细胞自噬及活化受到显著抑制(P<0.01),这一结果与3-MA作用相似。结论:CCl4呈时间依赖性地促进大鼠HF,上调肝组织microRNA-181a表达及自噬水平;降低HSC-T6细胞microRNA-181a表达可抑制TGF-β1诱导的细胞自噬;大鼠HF与microRNA-181a调控HSCs自噬有关。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

TGF-β1诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及上皮间质转换

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)活化及上皮间质转换(EMT)中的作用。方法体外培养HSC-T6,用MTT法筛选TGF-β1对HSC-T6作用的最佳浓度;用10μg/L TGF-β1处理HSC-T6 24 h,相差倒置显微镜下观察细胞形态改变,免疫荧光染色法检测细胞骨架结构F-actin蛋白的表达,RT-q PCR法检测肌动蛋白α-SMA及代表上皮间质转换的神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和上皮黏附素(E-cadherin)基因表达;用不同浓度(0、5和10μg/L)的TGF-β1处理HSC-T6 24 h,Western blot检测α-SMA、N-cadherin、vimentin和E-cadherin蛋白表达。结果 10μg/L TGF-β1干预HSC-T6 24 h有最好的细胞存活率;TGF-β1刺激HSC-T6后,细胞拉伸,伪足增多呈星形,细胞间连接疏松,呈显著活化状态;F-actin聚集形成应力纤维丝,沿细胞长轴分布;实验组α-SMA mRNA及vimentin mRNA的表达量明显高于对照组(P0.05),而E-cadherin mRNA的表达量明显降低(P0.05);在不同浓度的TGF-β1呈剂量依赖性致α-SMA及N-cadherin和vimentin的蛋白表达量增多,而E-cadherin的蛋白表达量减少。结论 TGF-β1可诱导HSC-T6活化及上皮间质转换。     

miR-146a介导PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞诱导的肝纤维化

目的探讨微小RNA(miR)-146a在转化生长因子-β1 (TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化中的作用,并通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路观察其对肝纤维化的影响。方法采用四氯化碳(CC1_4)建立肝纤维化大鼠模型,检测大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅰ型胶原(Ⅰ-C)水平,Masson染色观察肝组织病变,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测肝组织miR-146a表达,蛋白免疫印迹实验(Westem blot)检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PI3K和磷酸化(P)-Akt蛋白表达。HSC (肝星状细胞)-T6细胞分为Normal组、TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组和TGF-β1+miR-M组。TGF-β1+miR-NC组和TGF-β1+miR-M组分别转染miR-146a mimics阴性对照物和miR-146a mimics,然后除Normal组外,其余各组采用TGF-β1诱导HSC-T6细胞。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察细胞增殖情况,Real-time PCR法检测miR-146a表达,Western blot法检测α-SMA、Ⅲ-C、Ⅰ-C、PI3K和p-Akt蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织胶原沉积明显增加,纤维增生显著;血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平显著升高;肝组织miR-146a表达明显降低;而PI3K和P-Akt蛋白表达明显增加。TGF-β1组和TGF-β1+miR-NC组HSC-T6细胞各指标差异均无统计学意义。与TGF-β1+miR-NC组比较,TGF-β1+miR-M组miR-14表达明显增加,细胞活性、α-SMA表达、Ⅲ-C和Ⅰ-C均明显降低,PI3K和P-Akt蛋白表达明显下调。结论 miR-146a能够抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化,其抗肝纤维化机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

IGFBP-rP1对肝星状细胞活化及核因子-κB活性的影响

目的：明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBP-rP1）是否具有活化肝星状细胞（HSC）、增加细胞外基质（ECM）合成的作用；并探讨可能的信号转导途径。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）和不同浓度的 IGFBP-rP1 处理组，干预因素处理24 h后收集细胞爬片或制备单细胞悬液，采用免疫细胞化学染色观察HSC-T6中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMΑ）、I型胶原（collagen I）、纤维连接蛋白（FN）的表达变化；流式细胞仪检测HSC-T6中核因子-κB p65（NF-κB p65）的DNΑ结合活性。结果：免疫细胞化学染色结果发现，IGFBP-rP1各处理组α-SMΑ、collagen I、FN的表达均较空白对照组显著增强，且在一定范围内呈剂量依赖关系；流式细胞仪检测结果显示，IGFBP-rP1各处理组NF-κB p65阳性细胞百分数均较空白对照组明显增高。结论：IGFBP-rP1可以激活HSC，且在一定剂量范围内随着IGFBP-rP1剂量的增加HSC活化的程度逐渐增强；IGFBP-rP1可使ECM的重要组成成分collagen I和FN的合成增加；IGFBP-rP1可增强HSC中NF-κB p65的DNΑ结合活性。     

氯喹对体外活化肝星状细胞自噬与胶原代谢的影响

目的:研究不同浓度的自噬抑制剂氯喹(CQ)对活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响及可能机制。方法:应用转化生长因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6细胞,给予CQ干预24 h。实验分组为:control组、TGF-β1组、TGF-β1+CQ(15μmol/L)组、TGF-β1+CQ(30μmol/L)组和TGF-β1+CQ(60μmol/L)组。采用Western blot技术检测微管相关蛋白轻链3(LC3)比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表达情况;免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;RT-q PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA的表达变化。结果:CQ干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高且呈剂量依赖性;P62蛋白表达TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组(P0.01)。TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较control组显著增加,TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。α-SMA的表达在TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于control组(P0.05),而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著差异。MMP-13表达在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降(P0.05);TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著升高(P0.05),且呈剂量依赖性。结论:自噬抑制剂CQ能显著增加HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性,这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达并抑制MMP-13表达有关。     

缺氧在肝星状细胞激活中的作用机制

目的:探讨缺氧在肝星状细胞(HSC)激活中的作用机制.方法:缺氧培养大鼠HSC株HSC-T6,逆转录PCR检测HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA的表达,Westren blot检测α-SMA表达.缺氧/常氧下,加TGF-β1中和抗体、HIF-1α诱导剂氯化钴(CoCl2)或抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2),逆转录PCR检测HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA的变化.结果:缺氧能诱导HSC-T6表达HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA及α-SMA蛋白;常氧下CoCl2能诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mR-NA,TGF-β1中和抗体及2ME2能减弱缺氧诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA,但表达量仍高于常氧培养.结论:缺氧能激活HSC,分泌Ⅰ型胶原,增加细胞外基质沉积,其作用机制既依赖于TGF-β的胞内信号传导机制,也与HIF-α介导的信号传导有关,在肝纤维化形成中起着举足轻重的作用.     

PI3K/PKB信号通路在TGF-β_1诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白中的作用

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白(OPN)的调控作用。方法:体外培养LX-2人肝星状细胞株,予TGF-β1(终浓度2.5、5、10、20μg/L)刺激24 h或予TGF-β1(终浓度10μg/L)刺激12 h、24 h、48 h;先经PI3K/PKB信号通路特异性抑制剂wortmannin(0.1μmol/L)预处理1 h,再予10μg/L TGF-β1刺激24 h,收集细胞,采用real-time PCR及Western blotting法检测OPN表达情况。结果:TGF-β1能够促进LX-2细胞表达OPN,在一定浓度和时间范围内,其表达量随着TGF-β1浓度和时间的增加而增加,呈剂量和时间依赖性关系;经wortmannin预处理再予TGF-β1刺激的LX-2细胞,与对照组相比,OPN表达受到明显抑制(P0.01)。结论:TGF-β1对LX-2人肝星状细胞OPN表达具有诱导作用,此作用可能受PI3K/PKB信号通路的调控。     

抗IGFBPrP1抗体对小鼠肝纤维化的预防作用及其机制的研究

目的: 明确抗胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)抗体能否预防硫代乙酰胺(TAA)诱导的小鼠肝纤维化的形成,同时探讨其机制。方法: 将24只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为正常对照组、TAA 4周组和TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组,每组8只,观察肝组织形态学改变,免疫组织化学染色和Western blotting检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)、Smad3、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、Ⅲ)及IGFBPrP1的表达。结果: TAA 4周组肝损伤严重,α-SMA、TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3、FN、collagen Ⅰ、Ⅲ及IGFBPrP1的表达明显高于正常对照组(P＜0.01),TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组肝损伤减轻,上述各指标表达均低于TAA 4周组(P＜0.01)。IGFBPrP1与TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3 、FN及collagen Ⅰ的表达呈正相关(P＜0.01)。结论: 抗IGFBPrP1抗体可预防TAA诱导的小鼠肝纤维化的形成,其机制为抑制肝星状细胞的活化和减少细胞核内p-Smad2/3的表达、抑制TGF-β₁/Smad3信号通路,进而导致细胞外基质在肝组织中沉积减少。     

芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

背景：研究发现,芒柄花素具有抗氧化、抗炎和免疫调节等生物活性。然而,芒柄花素是否具有调节葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的作用尚不明确。目的：探究芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞HSC-T6氧化应激的作用及可能的机制。方法：实验分为对照组,模型组,芒柄花素低、中、高剂量组和姜黄素组。对照组不做任何处理,模型组用葡萄糖氧化酶处理2 h,芒柄花素组和姜黄素组先用不同浓度的芒柄花素或姜黄素处理HSC-T6细胞24 h,再用葡萄糖氧化酶处理2 h。采用CCK8法检测芒柄花素对HSC-T6细胞活力的影响;化学试剂盒检测各组细胞中超氧化物歧化酶和丙二醛水平;DCFH-DA荧光探针检测各组细胞中活性氧表达;ELISA检测各组细胞培养上清液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平;免疫细胞荧光染色观察各组细胞中Ⅰ型胶原表达;Western blot检测各组细胞中Ⅰ型胶原、NOX4和Nrf2蛋白表达。结果与结论：(1)与模型组比较,芒柄花素能抑制HSC-T6细胞的活化增殖(P <0.05);(2)与对照组比较,模型组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活性和Nrf2蛋白表达均明显减低(P &...     

胰岛素样生长因子结合蛋白2、4在实验性肝细胞损伤中的表达及意义

目的：通过观察肿瘤坏死因子α (TNF -α)和转化生长因子β1（TGF-β1）两种细胞因子所致体外培养的肝细胞损伤时胰岛素样生长因子结合蛋白2、4(IGFBP2、IGFBP4)的表达变化,探讨IGFBP2和IGFBP4在肝损伤中的作用机制。方法：对人肝细胞株HL-7702分别给予不同浓度的TNF-α、TGF-β1两种处理因素作用24 h,采用免疫细胞化学染色法观察其IGFBP2和IGFBP4的表达变化,再在相同处理培养条件下用MTT比色法检测两种细胞因子对肝细胞抑制率的影响。根据MTT及预实验结果选择TNF-α 20 μg/L作用于人肝细胞株48h,采用Annexin-Ⅴ/PI双染色流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡发生率。结果：与对照组相比,各处理组IGFBP2、IGFBP4的表达均显著增加(P<0.05),其中在TNF-α 20 μg/L组和TGF-β1 4 μg/L组表达最强,且与肝细胞抑制率呈正相关关系(P<0.05 or P<0.01)。TNF-α 20 μg/L处理48 h后肝细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论：IGFBP2、IGFBP4参与了肝细胞的损伤过程,在TNF-α、TGF-β1介导的肝细胞损伤中具有重要作用。     

碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化

目的:探究碧萝芷对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化的影响。方法:5μg/L TGF-β1和不同浓度碧萝芷(0、10、25、50 mg/L)分别作用于LX-2细胞,在有或无自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059的情况下,用MTT法检测细胞活力的变化,Western blot实验检测α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与对照组相比,5μg/L TGF-β1组的LX-2细胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明显增加(P0.05)。而碧萝芷预处理能逆转上述效应,并呈现一定的剂量依赖性,50 mg/L碧萝芷的抑制效果最为显著(P0.05)。而且,与TGF-β1组相比较,50 mg/L碧萝芷、5 mmol/L 3-MA或者20μmol/L PD98059预处理下,TGF-β1诱导的LX-2细胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显下调(P0.05)。结论:碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化。     

IL-10抑制TGF-β1诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖及表型转化

目的研究白细胞介素10(IL-10)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFBs)增殖、向肌样成纤维细胞(Myo Fbs)转化的影响及其作用通路。方法原代培养SD乳鼠CFBs,应用第2~4代,分为对照组、IL-10刺激组、TGF-β1刺激组、IL-10与TGF-β1共同刺激组(IL-10预处理后加入TGF-β1)。每个刺激组设3个复孔,所有实验重复3次。四氮唑盐比色法检测细胞增殖,免疫细胞化学染色检测增殖细胞核抗原表达,免疫细胞化学染色及Western blot检测α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)和ERK1/2、P38激酶磷酸化蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1(10μg/L)能显著刺激CFBs增殖及表型转化(α-SMA表达)(P0.01),用IL-10(10、50和100μg/L)预处理后,TGF-β1诱导的CFBs增殖及α-SMA表达呈剂量依赖性被显著抑制(P0.01)。TGF-β1能显著刺激CFBs内ERK1/2和P38磷酸化水平(P0.01),而IL-10(100μg/L)预处理后,TGF-β1诱导的ERK1/2和P38激酶磷酸化被明显抑制(ERK1/2:P0.05;P38:P0.01)。结论 IL-10可能通过抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制了TGF-β1诱导的CFBs增殖及向Myo Fbs转化。     

TGF-β对缺氧环境下HepG2细胞表达VEGF的影响

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和低氧(CoCl2)对肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养肝癌细胞系HepG2细胞,实验分为对照组、不同浓度TGF-β1和CoCl2的分别处理组、TGF-β1(100 pmol/L) CoCl2(200 μmol/L)组;用免疫细胞化学法检测VEGF蛋白表达;半定量RT-PCR技术检测细胞中VEGFmRNA相对表达量。结果各处理组VEGF蛋白表达均为阳性;TGF-β1或CoCl2组中VEGF mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.01),并且呈浓度依赖性;TGF-β1 CoCl2组中VEGFmRNA表达高于单因素刺激组(P<0.05)。结论TGF-β1能够刺激HepG2细胞表达VEGF,并且可以协同CoCl2增加VEGF的表达。     

改良的体外中枢神经系统损伤后胶质瘢痕模型的建立

目的建立胶质疤痕体外模型,观察其形态及细胞外基质的表达情况。方法体外分别培养来自大脑皮层的星形胶质细胞和脑膜成纤维细胞,经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和纤连蛋白(FN)抗体免疫细胞化学染色鉴定后,将两种细胞混合共培养,2d后添加转化生长因子-β1(TGF-β1),以未添加TGF-β1为对照组;GFAP和FN免疫细胞化学染色观察胶质疤痕的形态;免疫细胞化学染色和Western blotting观察促红素肝细胞受体B2(Eph B2)、Eph受体作用配体B2(ephrin B2)、神经蛋白聚糖(neurocan)和神经抗原2(NG2)表达情况。结果疤痕样细胞团簇结构主要是由星形胶质细胞和成纤维细胞共同组成;实验组Eph B2、ephrin B2和neurocan、NG2表达量较对照组明显增加(P0.05)。结论体外混合培养星形胶质细胞与成纤维细胞并添加TGF-β1后成功建立体外中枢神经系统损伤后疤痕模型。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

鳖甲煎改良方对肝星状细胞生长及TGFβ1、Smad3与Smad7表达的影响

目的探讨鳖甲煎改良方(modified turtle shell decoction,MTSD)对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6)TGFβ1、Smad3及Smad7表达的影响。方法用含生药量为0.71 g/ml的MTSD处理HSC-T6作为实验组,与MTSD剂量相同的鳖甲煎丸(turtle shell pills,TSP)处理的HSC-T6作为阳性对照组,常规培养的HSC-T6作为正常对照组,倒置显微镜下观察比较各组HSC-T6的形态变化。CCK-8检测各组HSC-T6细胞的生长情况,并绘制生长曲线;采用Real time-PCR、免疫荧光细胞化学及Western blotting技术分别检测各组HSC-T6的TGFβ1、Smad3及Smad7基因及其编码蛋白的表达变化。结果倒置显微镜下观察显示,与阳性对照细胞比较,MTSD处理48 h的HSC-T6,胞体变小,部分细胞死亡碎裂。CCK-8检测证实,MTSD对HSC-T6生长具有抑制作用,与2个对照组比较,MTSD处理的HSC-T6的生长减慢,从48 h开始差异具有统计意义(P0.01)。Real time-PCR、免疫荧光细胞化学及Western blotting检测显示,MTSD能在m RNA及蛋白水平明显下调HSC-T6的TGFβ1、Smad3的表达,上调其Smad7的表达,与2个对照组相比,差异均具统计学意义(P0.01)。结论 MTSD能有效抑制HSC-T6的生长,下调其TGFβ1、Smad3的表达,同时使Smad7的表达上调。MTSD抑制HSC-T6的生长可能与干扰TGFβ1/Smad3信号通路密切有关。     

sTβRⅡ拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化

目的研究可溶性转化生长因子-β1Ⅱ型受体(sTβRⅡ)对新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化的抑制效应。方法培养新生大鼠的心肌成纤维细胞,随机分为4组:PBS对照组、TGF-β1(5ng/ml)组、sTβRⅡ(50ng/ml)组和TGF-β1+sTβRⅡ组。30min、1h和2h后,免疫细胞化学染色检测P-Smad2和Smad3的表达;24h后,免疫细胞化学染色检测α-SMA的表达。结果与PBS对照组相比,TGF-β1组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达显著性升高(P0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+sTβRⅡ组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达明显降低(P0.05)。结论sTβRⅡ可拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad2/Smad3蛋白的磷酸化与核转位,阻断Smad信号转导通路,抑制肌成纤维细胞分化。