绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

利用流感病毒反向遗传学操作系统表达绿色荧光蛋白(EGFP)

目的 构建基于RNP复合体的流感病毒反向遗传学操作系统,并利用该系统表达绿色荧光蛋白.方法 将人源pol Ⅰ启动子分别插入真核表达载体pcDNA3和原核质粒pUC18,获得pol Ⅰ/pol Ⅱ双启动子表达载体pCHBW和pol Ⅰ单启动子表达载体pPol IR;来源于禽流感病毒H5N1湖北分离株A/Chicken/Hubei/489/2004的基因被克隆到pCHBW上,获得pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP;将荧光蛋白基因置换NA基因的编码区进而克隆到pPol IR上获得pPol IR-NA (EGFP);这些质粒共转染293T细胞并观察荧光.结果 所构建的载体均经酶切和测序验证正确.pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP和pPol IR-NA (EGFP)共转染293T细胞后能观察到绿色荧光,Western-blot实验证实被转染的293T细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP).结论 基于RNP复合体的反向遗传操作系统构建成功,并表达绿色荧光蛋白.     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

环境镉离子生物检测工程菌株的构建及应用

目的 以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，和重金属镉特异性启动子PcadA构建成基因工程重组体，用于重金属镉的特异性检测。方法 采用聚合酶链（PCR）方法从质粒pPcadA上扩增得到重金属镉离子特异性诱导启动子PcadA，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以大肠埃希菌．枯草杆菌穿梭载体pNW33N构建了绿色荧光蛋白镉离子诱导表达载体。以枯草芽孢杆菌1A751为宿主菌，采用感受态转化法将表达载体导入1A751，成功构建镉离子检测菌株。结果 通过酶切鉴定、PCR和DNA序列分析，重组载体构建成功，并在有镉离子存在的环境中得到表达。结论 该工程菌株能够以绿色荧光蛋白基因为报告基因检测培养体系中最低浓度达0．1μmol／L的镉离子；利用该菌株有望建立起一种方便快捷的重金属镉的检测方法，有较高的应用价值。     

重组质粒pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG的构建及其在细胞内的表达和定位

目的分别构建先天性长QT综合征(LQTS)相关HERG基因和E637K突变基因与红色和绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-bERG,观察其在细胞内的表达和定位情况。方法将克隆在pcDNA3上的HERG和E637K片段分别亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上,转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot技术和荧光显微镜观察重组质粒蛋白表达和细胞内定位情况。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误。转染pmCherry-WT-hERG野生型质粒的细胞可以检测到135 kD和155 kD 2条蛋白质条带,而转染pEGFP-E637K-bERG突变型质粒的细胞仅显示1条135 kD蛋白质条带,155 kD处条带缺失。融合蛋白发出的红色和绿色荧光表明,突变型蛋白分布于胞浆中,而野生型蛋白主要位于胞膜上。结论成功构建了pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,为LQTS突变基因的进一步功能研究奠定了基础。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用

目的　将绿色荧光特征引入大肠杆菌E coliO15 7∶H7,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究。方法　将pGFP质粒转化E coliO15 7∶H7,构建一种工程菌 (E coliO15 7∶H7 pGFP) ,并进行了选择性培养基的筛选。以E coliO15 7∶H7 pGFP对鸡肉与牛奶等食品样品进行接种与回收试验 ,同时设定不同温度模拟食品储存的不同情况。结果　pGFP质粒可以在E coliO15 7∶H7菌株中稳定存在。将E coliO15 7∶H7 pGFP接种食品样品 ,以LBan培养基平板回收发现 :较高温度存放肉类与牛奶 ,其污染的E coliO15 7∶H7菌量可在 12h增加 35 0 0 0～ 2 0 0 0 0 0倍 ,而 4℃存放可以使污染菌量缓慢下降。结论　构建了一种具有紫外灯下发出绿色荧光与氨苄青霉素抗性等特性的重组菌株———O15 7∶H7 pGFP ,并设计了适合E coliO15 7∶H7 pGFP生长的选择性培养基———LBan。该重组菌株可应用于检测方法的改进及该菌特性的研究 ,是一种非常有用的工程菌     

重组腺病毒方法的改建

目的对构建重组腺病毒的AdEasy载体系统的操作过程予以改进，使其更加简便、高效。方法将腺病毒骨架载体pAdEasy-1用电穿孔法转化大肠埃希菌BJ5183，获得含pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183／p菌株。氯化钙法制备大肠埃希菌BJ5183／p感受态细胞，并转化含绿色荧光蛋白的穿梭载体，通过同源重组获得重组腺病毒质粒。以限制性内切酶PacⅠ酶切，得到重组腺病毒DNA分子，转染293细胞。结果293细胞出现细胞病变，荧光显微镜观察有绿色荧光。结论成功获得一种以AdEasy系统为基础的简便、高效构建重组腺病毒的新方法。     

戊型肝炎病毒嵌合蛋白的免疫应答的初步研究

目的：对含有HEV主要抗原表位的嵌合蛋白进行表达与纯化，并对其免疫原性进行研究。方法：将含有一段HEV ORF2基因片段（394-660aa）和HEVORF3全基因的表达质粒pHEV23在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，其表达产物经Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化，透析复性。纯化蛋白免疫小鼠，用ELISA检测小鼠血清IgG抗体，T细胞增殖反应检测细胞免疫应答。以Western-blot检测纯化蛋白对患者阳性血清的免疫反应性。结果：纯化蛋白的分子量为55KDa，纯度达90％以上；实验组特异性抗体水平明显高于对照组；T细胞增殖反应实验组与对照组比较有极显著性差异。纯化蛋白能与患者阳性血清呈特异反应。结论：嵌合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。     

N-端融合蛋白对重组HBeAg抗原性的影响

目的　研究 Ｎ－ 末端融合蛋白对大肠杆菌中表达的 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 抗原性的影响。方法　用 Ｐ Ｃ Ｒ 法,从抗－ Ｈ Ｂｃ（ ＋ ） 血清标本中获得 Ｈ Ｂ Ｖ Ｐｒｅ ｃ － ｃ 基因片段,将其插入质粒 Ｔｒｃ９９ Ａ,重组成亚克隆 Ｐ Ｈ Ｂ Ｉ。以 Ｐ Ｈ Ｂ Ｉ为模板,扩增获得编码乙肝病毒核心蛋白１ ～１４０ 氨基酸的基因片段,加上终止信号,分别插入质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ－ ２ Ｔ 和 Ｔｒｃ９９ Ａ 中,各自转化后,以 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,大肠杆菌表达插入基因。以 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 方法测定表达产物的分子量和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｃ Ａｇ 滴度。结果　在 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导下,大肠杆菌中分别表达 Ｎ－ 端融合的 Ｇ Ｓ Ｔ－ Ｈ Ｂｅ Ａｇ 融合蛋白和非融合 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 蛋白。分子量各为４１０００ Ｄ 和１５０００ Ｄ。培养裂解物经 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定,融合蛋白 Ｈ Ｂｅ Ａｇ ： Ｈ Ｂｃ Ａｇ 的滴度比为２５６ ：１ ,非融合蛋白为１６ ：１ 。结论　 Ｎ－ 端融合蛋白 Ｇ Ｓ Ｔ－ Ｈ Ｂｅ Ａｇ 抗原性更接近血清 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 。     

In vitro and ex vivo green fluorescent protein expression in alveolar mammary epithelial cells and mammary glands driven by the distal 5'-regulative sequence and intron 1 of the goat beta-casein gene

The 5'-regulative sequence and intron 1 of the goat beta-casein gene from -4044 to +2123 bp was cloned and fused with the reporter gene of green fluorescent protein (GFP) to create a plasmid termed pGB562/GFP. To detect GFP expression, pGB562/GFP was transfected in vitro via liposomes into the mammary epithelial cell line NMuMG. Cells could not express GFP unless the transfected NMuMG cells lined up to create functional alveoli. These functional cells were cultured with lactogenic hormones, including insulin, dexamethasone and prolactin, and were grown on a layer of the extracellular matrix Matrigel. Green fluorescent protein expression levels in NMuMG cells were 25-, 55- and 42-fold those in the control group at 24, 48, and 72 h after pGB562/GFP transfection respectively. In addition, pGB562/GFP was transfected ex vivo by electroporation into mammary gland fragments and cells were then cultured in vitro with a supplement of lactogenic hormones. Strong GFP expression localized in fragments of the mammary gland was observed 24 h after gene transfer. The novel strategy of ex vivo gene transfer into mammary tissue using GFP as a reporter gene to detect the function of a tissue-specific promoter is efficient and convenient. The data obtained herein reveal that the 5'-regulative sequence and intron 1 of the 6.2 kb goat beta-casein gene can enhance the efficiency of transgene expression. Thus, the GB562 sequence may act as a good promoter and effectively elevate the production of exogenous protein in mammary glands.     

Introduction and expression of foreign genes in cultured mouse embryonic gonads by electroporation

To analyse the functions of genes that are expressed and potentially involved in the development of embryonic gonad cells, a method was developed by which foreign genes can be introduced and expressed in cultured mouse genital ridges. Genital ridges from mouse embryos at 12.5 days post coitus (dpc) were injected with plasmid DNA of a green fluorescence protein (GFP) gene construct and then placed between small electrodes. Rectangular pulses were charged to electroporate DNA into the cells. The treated genital ridges were cultured on a membrane of a culture insert, and GFP gene expression was observed under a fluorescence microscope. Green fluorescence protein expression in the genital ridges was found as early as 1 h after electroporation. Thereafter, the expression gradually increased, peaked after 1 day, and then decreased. A significant number of cells were, however, still positive for fluorescence even after 2 weeks in the culture, in which both gonads and germ cells had continued to develop. The GFP gene was expressed in 1-2% of cells in each genital ridge in a DNA concentration-dependent manner. In addition, we confirmed that an electroporated red fluorescent protein (DsRed) gene construct was expressed in GFP-expressing primordial germ cells in genital ridges of Oct-4/GFP transgenic embryos, although the DNA was mainly found in somatic cells in genital ridges. Finally, an expression vector containing the internal ribosome entry site-green fluorescent protein (IRES-GFP) gene was constructed. An inserted lacZ gene showed similar expression pattern to that of GFP Using this vector, we can easily monitor the expression of an inserted gene of interest by GFP expression. Therefore, this experimental system could be useful for quick assays of gene function in genital ridges.     

脓毒症时肠道细菌易位发生部位的研究

目的:研究脓毒症时肠道细菌易位发生的部位。方法:将36只大鼠随机分对照组和脓毒症组,各组内随机分为空肠组、回肠组和结肠组。空肠组大鼠于Treitz韧带处空肠置管,距离Treitz韧带20cm处造口;回肠组于回盲部上20cm处肠道置管,末端回肠造口;结肠组行盲肠置管。各组分别于肠道置管口灌入绿色荧光标记的大肠杆菌和乳果糖/甘露醇,于术后行肠道通透性检测,24h后荧光显微镜下观察大鼠肠系膜淋巴结、肝、脾组织中标记细菌的数量,肠系膜淋巴结细菌培养,并在荧光显微镜下观察。结果:空肠组、回肠组和结肠组大鼠肠黏膜的通透性和肠系膜淋巴结荧光细菌计数存在差异,回肠组明显高于空肠组和结肠组。结论:脓毒症时,各肠段细菌易位程度不同,回肠内易位细菌数量最多。