佛波酯诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞的条件优化

目的优化诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞所需的佛波酯(PMA)浓度和刺激时间。为研究生物活性材料对巨噬细胞表型和功能的调控作用奠定实验基础。方法分析不同PMA浓度与刺激时间下THP-1细胞的形态、贴壁程度、 M0型巨噬细胞表面标志物以及巨噬细胞M1和M2表型相关基因的表达。结果在25～100 ng/mL PMA浓度范围和24～72 h刺激时间范围内,当PMA浓度为75 ng/mL,刺激时间为72 h时,既能有效诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞,又能对THP-1细胞中M1型巨噬细胞标志基因IL-6、 IL-1β、 CD86和M2型巨噬细胞标志基因IL-10、 CD163、 CD206产生相对较低的上调作用。结论优化的诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞所需的PMA浓度和刺激时间为75 ng/mL和72 h。     

长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1对巨噬细胞极化影响的研究

目的研究长链非编码RNA(lnc RNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对巨噬细胞极化的影响。方法采用佛波酯诱导人THP-1细胞分化为成熟的巨噬细胞,IFN-γ/LPS刺激诱导M1型极化,IL-4刺激诱导M2型极化,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测各组细胞中MALAT1的表达。si RNA干扰巨噬细胞MALAT1表达,加入IL-4继续诱导M2型极化,RT-q PCR检测极化相关基因表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-12、CCL22、IL-10的水平。si RNA干扰M2型巨噬细胞MALAT1表达,研究其对M2极化表型的影响。结果 MALAT1在M2型巨噬细胞中表达显著升高,M1向M2极化改变MALAT1表达升高,而M2向M1极化改变MALAT1表达降低。MALAT1干扰后,IL-4诱导的M2型巨噬细胞TNF-α、IL-12分泌升高,CCL22、IL-10分泌降低;CXCL10、CXCL11、HLA-DR表达升高,CCL17、CCL18、CD163表达降低。M2型巨噬细胞MALAT1干扰后,TNF-α、IL-12分泌升高,CCL22、IL-10分泌降低。结论 MALAT1参与调控巨噬细胞极化,干扰MALAT1表达有效抑制M2型巨噬细胞极化,促进M1型巨噬细胞极化。     

猪苓多糖对M1型巨噬细胞细胞因子表达的调节作用

目的通过诱导构建M1型巨噬细胞模型研究猪苓多糖对白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和转化生长因子β(TGF-β)、IL-10 mRNA的表达影响,探讨猪苓多糖对巨噬细胞的免疫调节机制。方法实验分为空白对照组、γ干扰素(IFN-γ)诱导的M1型巨噬细胞模型组、猪苓多糖高中低剂量组,浓度分别为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL。用IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞,用流式细胞术检测M1型巨噬细胞特异性指标CD16/CD32、CD86的表达,实时荧光定量PCR检测IL-1β、IL-10、iNOS、TNF-α、TGF-β的mRNA表达,观察不同剂量猪苓多糖对M1型巨噬细胞的影响。结果与空白组比较,IFN-γ的诱导RAW264.7巨噬细胞分化M1型巨噬细胞的特异性标志物CD16/CD32、CD86的表达明显升高。100μg/mL猪苓多糖组在3、6、9、12、24 h,IL-1β、iNOS、IL-10、TGF-β、TNF-α的mRNA表达升高,不同剂量猪苓多糖给药6 h后各因子的表达量升高(P0.01)。结论 IFN-γ单独作用于巨噬细胞,可以有效的诱导RAW264.7巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞;猪苓多糖促进M1型巨噬细胞IL-1β、iNOS、IL-10、TNF-α的mRNA表达。     

结直肠癌细胞来源的外泌体miR-34a对M2型巨噬细胞极化的影响北大核心CSCD

目的:探究结直肠癌来源的外泌体对巨噬细胞极化的影响及其作用机制。方法:建立THP-1来源的M2型巨噬细胞体外诱导分化模型,利用流式细胞染色实验检测细胞分化效率;通过与结直肠癌细胞共培养、结直肠癌细胞外泌体干预M2型巨噬细胞分化,利用实时荧光定量PCR实验检测ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA的表达水平。结果:体外诱导分化的M2型THP-1巨噬细胞CD163阳性细胞比例显著升高;与对照组相比,与结直肠癌细胞HCT8和HCT116共培养的M2型巨噬细胞ARG1、IL-10表达水平显著升高,NLRP3表达水平下降。与转染阴性对照microRNA(miR-NC)组相比,转染miR-34a inhibitor的HCT8和HCT116共培养或外泌体刺激下,M2型巨噬细胞ARG1、IL-10表达水平下降,NLRP3表达水平升高;与miR-NC组相比,转染miR-34a inhibitor的THP-1细胞ARG1、IL-10表达水平显著下降,NLRP3表达水平显著升高。结论:结直肠癌细胞来源的外泌体miR-34a可以抑制巨噬细胞NLRP3的表达,促进巨噬细胞M2型极化。     

小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养及极化相关实验方法的建立

目的 建立小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养,并将其极化为M1和M2型巨噬细胞的方法.方法 获取小鼠骨髓细胞,以GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化发育,并辅以LPS和IFN-γ以及IL-4刺激巨噬细胞分别向M1型和M2型分化.采用流式细胞术、实时定量PCR和ELISA的实验检测极化后细胞内以及细胞培养上清中的标志性细胞因子如IL-12、IL-10、Argl、Yml、MMR等的表达情况.结果 形态学观察发现骨髓获取的细胞经诱导分化后呈现巨噬细胞特征性的贴壁形态；流式细胞术行胞内染色表明,极化后的M1型与M2型巨噬细胞各自表达其特征性的细胞因子IL-12和Argl；实时定量PCR和ELISA分别检测所培养细胞胞内以及培养上清中的细胞因子,结果表明所刺激的M1型巨噬细胞高表达IL-12、iNOS、TNF-α等炎性因子,而M2型巨噬细胞表达MMR、Argl、Yml等标志因子.结论 建立了稳定的M1和M2型巨噬细胞体外培养体系.     

外泌体miR-181b-5p诱导M2型巨噬细胞极化促进喉癌细胞转移的功能研究北大核心CSCD

目的:探究外泌体miR-181b-5p对巨噬细胞极化和喉癌转移的影响。方法:THP-1诱导分化为M0型的巨噬细胞,M0型巨噬细胞分为TU-212 exo、TU-177 exo、Hep-2 exo、NP69 exo、miR-NC exo、miR-181b-5p exo组和PBS组。外泌体诱导后的巨噬细胞与TU-212细胞共孵育,qRT-PCR检测miR-181b-5p、TNF-α、CCR7、Arg1、CD206、CD163表达,Western blot检测PI3K p110γ、PTEN、p-AKT、AKT表达,Transwell小室法检测各组细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p与PTEN的靶向关系。结果:TU-212、TU-177、Hep-2细胞及其外泌体中miR-181b-5p高表达,TU-212 exo、TU-177 exo、Hep-2exo、miR-181b-5p exo促进巨噬细胞中miR-181b-5p、Arg1、CD206、CD163、PI3K p110γ表达及AKT磷酸化,抑制PTEN、TNF-α、CCR7表达。PTEN为miR-181b-5p的靶基因。TU-212 exo、TU-177 exo、Hep-2 exo、miR-181b-5p exo诱导的巨噬细胞显著促进TU-212细胞的迁移和侵袭。结论:外泌体miR-181b-5p激活PTEN/PI3Kγ信号通路诱导M2型巨噬细胞极化,从而促进喉癌细胞的转移。     

猪苓多糖对巨噬细胞RAW264.7的双向免疫调节作用

目的观察猪苓多糖对γ干扰素(IFN-γ)诱导M1亚型巨噬细胞膜表面蛋白的影响及对相关细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-αm RNA的作用,探讨猪苓多糖对巨噬细胞的免疫调节作用。方法实验分为空白对照组、IFN-γ模型组、猪苓多糖组和IFN-γ加猪苓多糖组。IFN-γ诱导巨噬细胞极化为M1型后用猪苓多糖干预,采用流式细胞术检测膜蛋白CD14、TLR4、CD86、CD40、CD16/32的阳性表达率,ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-17及IL-10的表达量,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β及IL-10 m RNA的相对表达量。结果 IFN-γ可单独诱导M1巨噬细胞模型,猪苓多糖作用于M1型巨噬细胞,分泌的因子增加,但是对膜蛋白影响不大;猪苓多糖单独作用于巨噬细胞,可以增加膜白蛋的表达量,分泌的因子和空白对照组比较有统计学差异。结论猪苓多糖可以极化巨噬细胞为M1型,可以增加由IFN-γ诱导的M1炎症因子的表达,同时也增加抑炎因子的表达,有着双向的调节作用。     

乙型肝炎病毒及其核心抗原对巨噬细胞极化的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对巨噬细胞M1/M2极化的影响。方法:体外培养人白血病单核细胞系THP-1,用佛波酯将其诱导为人巨噬细胞,然后分别与HepG2/HepG2.2.15细胞和HBcAg共培养。通过流式细胞术观察共培养后THP-1巨噬细胞极化相关分子的变化;收集细胞培养上清,用ELISA检测巨噬细胞中促炎和抗炎细胞因子的分泌水平;应用RT-qPCR检测共培养后巨噬细胞极化相关分子和细胞因子的表达水平。结果:与HepG2细胞对照组相比,分泌HBV的HepG2.2.15细胞与THP-1巨噬细胞共培养能够上调其CD86和CCR7表达水平,同时促进IL-6、TNF-α和IL-10的分泌。而与HBcAg共培养后,THP-1巨噬细胞上CD163、CD206以及CD86表达水平升高,同时促进TGF-β、IL-10和TNF-α的分泌。结论:①HBV主要促进THP-1巨噬细胞向促炎的M1方向极化;②HBcAg主要促进THP-1巨噬细胞向抑炎的M2方向极化但同时也影响THP-1巨噬细胞向M1方向的极化。     

IL-33诱导的THP-1细胞对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨白介素33(interleukin 33,IL-33)对单核细胞THP-1的诱导分化作用以及IL-33诱导分化的THP-1对胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 IL-33刺激THP-1细胞72 h后流式细胞术检测M2巨噬细胞表面分子CD163及CD209的表达;ELISA检测细胞因子IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α的蛋白表达;qRT-PCR检测IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α的mRNA表达。克隆形成实验、细胞迁移侵袭实验检测IL-33刺激后的THP-1细胞与SGC7901共培养对SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响;Western blot检测共培养后SGC7901细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-cadherin、Vemintin以及Snail的表达。裸鼠成瘤实验检测TAM对体内肿瘤生长的影响。结果 IL-33诱导THP-1细胞表型向M2TAM方向分化;IL-33刺激THP-1促进了SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭能力;Western blot检测结果显示,经IL-33诱导的THP-1抑制SGC7901细胞E-cadherin的表达,促进Vemintin和Snail的表达,说明IL-33诱导分化的THP-1细胞促进SGC7901细胞发生EMT。IL-33刺激后的THP-1促进SGC7901细胞在裸鼠体内肿瘤的生长。结论 IL-33可以诱导THP-1发生M2型TAM的分化,分化后的TAM通过EMT机制促进胃癌SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭。     

炙甘草多糖对小鼠巨噬细胞再极化的影响

目的:建立探讨炙甘草中等分子量多糖(MPRR)诱导巨噬细胞极化的情况,阐明肿瘤微环境中极化后巨噬细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞生长的影响。方法:培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用IL-4诱导并建立M2型极化模型,将培养细胞分为未诱导细胞(M0)组、M2极化(IL-4诱导)组、MPRR诱导组和Rp组(IL-4诱导12 h后MPRR再极化诱导组),流式细胞术分析巨噬细胞极化标志(CD86和CD206)的表达。免疫印迹技术分析转录因子STAT-6表达和磷酸化。收集不同条件下巨噬细胞培养上清液,ELISA法检测其IFN-γ和TGF-β浓度。结果:与对照组比较,IL-4诱导后细胞发生M2极化,可检测到RAW264.7细胞表面CD86表达下降(P0.05),CD206表达增加(P0.05)。而MPRR促进细胞向M1极化,可观察到其促进CD86表达而降低CD206表达(P0.05)。M2极化后STAT-6磷酸化增加,IFN-γ分泌减少而TGF-β分泌增加(P0.05);经MPRR处理减弱STAT-6磷酸化和TGF-β的分泌,促进IFN-γ分泌(P0.05)。结论:炙甘草水溶性多糖促进巨噬细胞的M1极化,可拮抗IL-4诱导其M2极化效应,炙甘草多糖可调节小鼠巨噬细胞再极化。     

芍药苷通过介导THP-1源巨噬细胞极化抑制支气管上皮细胞炎症反应

为探讨芍药苷(paeoniflorin, PF)对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的影响及其机制,利用佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,CCK-8法检测PF对THP-1巨噬细胞的毒性,1μg/mL的LPS培养THP-1巨噬细胞以诱导炎症,分别用1、10和30μmol/L的PF处理24、48和72 h, CCK-8法检测细胞活力,筛选PF的最佳作用浓度和时间。在Transwell上室中接种BEAS-2B细胞,下室接种THP-1巨噬细胞,将THP-1巨噬细胞分成4组：对照组、LPS组、PF组、LPS+PF组。CCK-8法检测BEAS-2B细胞的存活率,FACS检测BEAS-2B细胞的凋亡率,ELISA检测炎性因子IFN-γ、IL-4、IL-17C、IL-10的水平,Western blotting检测CD63、CD9、凋亡转接基因2互作蛋白X(apoptosis-linked gene 2-interacting protein X, Alix)表达水平,FACS检测THP-1巨噬细胞中M1、M2型细胞标志物CD80和CD206的表达。结果显示,PF的最佳作用浓度和时间分别为10μ...     

过表达miR-16下调IL-4诱导分化的THP-1细胞IL-10和Arg1的表达

目的探讨慢病毒介导的miR-16对THP-1巨噬细胞表达白细胞介素10(IL-10)和精氨酸酶1(Arg1)的影响。方法利用重组人IL-4(rh IL-4)将THP-1细胞诱导分化为M2型巨噬细胞,利用ELISA检测诱导前后细胞IL-10的分泌,实时荧光定量PCR检测THP-1巨噬细胞诱导前后miR-16的表达;通过慢病毒感染获得miR-16过表达细胞;ELISA检测miR-16过表达细胞和对照细胞IL-10的分泌;流式细胞术检测miR-16过表达细胞和对照细胞IL-10的表达;Western blot法检测miR-16过表达细胞和对照细胞Arg1的表达。结果 THP-1细胞经IL-4诱导后,培养上清中IL-10的分泌逐渐增加,并在第6天达峰值。IL-4将THP-1细胞诱导为M2型巨噬细胞后,miR-16表达下调;慢病毒感染M2型巨噬细胞经嘌呤霉素筛选后GFP表达率提高至97.7%;ELISA检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组上清液中IL-10的分泌量为(72.15±0.16)pg/m L,较对照组(103.47±0.14)pg/m L低。流式细胞术检测显示miR-16过表达细胞IL-10的平均荧光强度(Gm)为3.47,胞内IL-10的表达水平较对照组(Gm=12.40)低。过表达miR-16后,M2型巨噬细胞中Arg1表达降低。结论慢病毒介导的miR-16能够抑制IL-4诱导分化的THP-1巨噬细胞中IL-10和Arg1的表达。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

M2型肿瘤相关巨噬细胞通过p53途径下调肝癌化疗敏感性的机制研究

目的 通过研究M2肿瘤相关巨噬细胞调控p53表达来下调肝癌化疗敏感性的机制,以此拓宽建立抗肿瘤耐药的措施.方法 构建小鼠肝癌模型及分离肝癌组织,研磨组织提取巨噬细胞,通过RT-PCR方法检测巨噬细胞表面CD206及CD163分子表达情况.培养人单核巨噬细胞(THP-1),PMA (100ng/mL)和IL-4 (100ng/mL)作用诱导分化成肿瘤相关巨噬细胞后,与肝癌细胞(HepG2、SMMC7721,Hep 3B)共培养,加入奥沙利铂(20μ g/mL)作用24小时,通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2及p53的表达,通过MTT方法检测化疗对肝癌细胞增殖情况.结果 成功构建了肝癌模型,分离出了肝癌组织巨噬细胞,RT-PCR检测CD206和CD163的表达显著升高;人单核细胞(THP-1)经加入PMA(100ng/mL)和IL-4 (100ng/mL)分化诱导48h后其细胞的表面CD206和CD163的表达明显高于THP1分化诱导的细胞表面表达量;肝癌细胞SMMC7721和HepG2与M2型肿瘤相关巨噬细胞共培养24h,经奥沙利铂作用后,肿瘤细胞Bcl-2表达明显升高,Caspase 3和p53的表达显著降低;肿瘤细胞的增殖抑制率明显降低,而Hep 3B细胞的凋亡则明显降低.结论 M2型肿瘤相关巨噬细胞调控肝癌细胞中p53的表达,进而抑制了肝癌化疗的敏感性.     

IRF1对M1巨噬细胞极化及其抗肿瘤效应的影响

目的研究IRF1对M1巨噬细胞极化及M1介导的抗肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建单核细胞U937来源M1巨噬细胞模型(U937-M1),将细胞分为4组:用PMA诱导的未活化巨噬细胞组(M0),用PMA,IFN-γ和LPS处理的M1型巨噬细胞组(M1),用siRNA干扰IRF1的M1型巨噬细胞组(si IRF1)以及阴性干扰的M1型巨噬细胞组(si C)。用流式细胞术检测M1/M2特异表面标志物CD86/CD206的表达;q PCR检测M1/M2相关基因(IL-12p35,IL-12p40,IL-23p19,IL-6,TNF-α/IL-10)及IFNB1的表达;ELISA检测IL-12p70,IL-10及IFN-β的表达;Western blot检测IRF1及IRF5的表达;CCK8和流式细胞术分别检测Hep G2及SMMC-7721增殖和凋亡。结果与U937-M1组相比,干扰IRF的M1组CD86表达降低,但CD206升高(P0.05);mRNA水平上,IL-12p35,IL-12p40,IL-23p19,IL-6,TNF-α以及IFNB1表达降低,但IL-10表达增高(P0.01);蛋白水平上,IL-12p70,IFN-β及IRF5表达降低,但IL-10表达增高(P0.05)。IRF1干扰后,M1巨噬细胞促进肝癌细胞增殖、抑制其凋亡(P0.05)。结论干扰IRF1后,M1巨噬细胞极化状态受损,甚至部分向M2型转变;其抗肿瘤效应转变为促肿瘤效应;且IRF1可能参与调节IFN-β与IRF5的表达。     

C1632通过MAPK和NF-κB抑制巨噬细胞M1型极化

目的 探讨C1632抑制巨噬细胞炎症和M1型极化的作用及机制。方法 RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞系）经LPS(10 ng/ml)和IFN-γ（20 ng/ml）处理24 h，诱导M1型极化后，分为对照组（DMSO 0.1%）、M1型巨噬细胞组（LPS和IFN-γ处理）、M1型巨噬细胞+C1632组（C1632质量浓度10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml）。CCK8和流式细胞术检测C1632对M1型巨噬细胞活性和凋亡的影响。显微观察巨噬细胞极化形态。定量PCR检测炎性分子（IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL10、iNOS）和Lin28以及let7家族水平。流式细胞术检测CD80、CD86和MHC2水平。Western blot检测p38和NF-κB的磷酸化水平。LPS腹腔注射构建脓毒症小鼠模型。结果 相较于对照组的M1型巨噬细胞，C1632处理后能明显抑制其活性和形态学改变，并且显著下调IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CXCL10等促炎因子的转录水平，抑制CD80、CD86和MHC2的蛋白水平。小鼠巨噬细胞中低表达或不表达Lin28，且C1632处理后...     

降低蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化促进巨噬细胞M1型分化

目的研究蛋白磷酸酶2A催化亚基C(PP2Ac)去甲基化在巨噬细胞M1型分化中的作用。方法 THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化为M0型巨噬细胞,再用脂多糖(LPS)、γ干扰素(IFN-γ)刺激48 h分化为M1型巨噬细胞;处理组和溶剂对照组在M1型巨噬细胞模型上,分别加入0. 5μmol/L ABL127和二甲基亚砜(DMSO)培养48 h。倒置显微镜观察细胞形态学变化,实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞分化标志物环加氧酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和C-X-C趋化因子配体10(CXCL10)的mRNA水平,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,Western blot法检测PP2Ac去甲基化水平。结果 M0型巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞,细胞伸出伪足逐渐呈梭形,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10的mRNA水平明显升高,吞噬功能增强,PP2Ac去甲基化表达下降;处理组加入0. 5μmol/L ABL127,与溶剂对照组相比,PP2Ac去甲基化水平明显降低,梭形细胞增多,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10明显增高,吞噬功能增强。结论降低PP2Ac去甲基化能促进M1型巨噬细胞分化,并增强巨噬细胞促炎性细胞因子表达和吞噬功能。     

去乙酰化酶抑制剂VPA 对巨噬细胞极化过程的影响

目的:本研究通过分析去乙酰化酶抑制剂对巨噬细胞极化过程中组蛋白修饰的影响,以及对巨噬细胞极化过程的影响,分析去乙酰化酶抑制剂是否可以通过改变巨噬细胞的组蛋白修饰,进而影响巨噬细胞极化的过程,旨在为治疗自身免疫性疾病提供新的思路。方法:利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)诱导J774.1巨噬细胞24 h,白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)诱导J774.1巨噬细胞24 h,并在诱导过程中加入2 mmol/L丙戊酸(Valproic acid,VPA),收集巨噬细胞,实时免疫荧光定量PCR和ELISA法检测巨噬细胞极化的特异性标记基因的表达,流式细胞术和细胞免疫荧光法检测组蛋白修饰情况。结果:J774.1细胞经LPS和IFN-γ诱导24 h极化为M1型巨噬细胞;经IL-4刺激24 h极化为M2型巨噬细胞,VPA处理后的M1型巨噬细胞组蛋白H3K9的乙酰化程度升高,标记基因白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、CC趋化因子配体2[Chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2]的表达量降低,CD86的表达量升高;VPA处理后的M2型巨噬细胞组蛋白H3K9的乙酰化程度也升高,标记基因精氨酸酶(Arginase-1,Arg-1)、Fizz-1(Found in inflammatory zone-1,Fizz-1)、甘露糖受体(CD206)、Ym1的表达量升高。结论:巨噬细胞的极化状态和组蛋白的修饰具有一定的相关性,VPA在M1型巨噬细胞诱导体系中可以促使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,但是在M2型巨噬细胞诱导体系中,却抑制了M1型巨噬细胞的特异性基因的表达。     

脂肪间充质干细胞诱导巨噬细胞向M2 型极化的实验研究

目的:探究脂肪间充质干细胞体外对炎症启动细胞——巨噬细胞的极化作用。方法:脂多糖(LPS,1μg/ml)模拟局部炎症,诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。收集培养过脂肪间充质干细胞的培养基(ADMSCCM)诱导M1型RAW264.7细胞向M2转化。检测M1和M2极化方向的相关指标,通过对IL-10、IGF-1、Arg-1、TNF-α、FIZZ1、SPHK-1的mRNA定量,以及通过Western蛋白质印迹法和荧光标记技术观察IL-10、IL-12 p40、IL-27 Rα的表达。结果:LPS诱导后的RAW264.7细胞,在经过ADMSCCM培养后,其M1相关指标(TNF-αmRNA、IL-12 p40;P0.05)显著下降,部分M2相关指标(IGF-1、IL-10 mRNA、IL-10;P0.05)明显上升。结论:脂肪间充质干细胞分泌的可溶性细胞因子,可诱导已向M1型极化的RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞极化。