抗汉滩病毒 NP抗原 mAb的 ScFv－ Cκ基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的构建抗汉滩病毒(HTNV)NP抗原mAb的ScFv-Cκ基因原核和真核表达载体。方法将鼠源性抗HTNVmAb1A8的ScFv基因和人Cκ基因连接,分别克隆入原核表达载体pComb3和真核表达载体pCI-neo中,并用间接免疫荧光和Western-blot检测其原核表达产物的活性。结果成功地构建了重组1A8-ScFv-Cκ基因并克隆入原核和真核表达载体。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,该基因在E.coliTG1中的表达产物可与HTNVNP抗原特异性结合。结论抗NP抗原mAb的ScFv-Cκ原核和真核表达载体的构建,为进一步研究细胞内抗体的功能奠定了基础。     

抗汉滩病毒NP抗原mAb的ScFv—Ck基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建抗汉滩病毒（HTNV）NP抗原mAb的ScFv-Ck基因原核和真核表达载体。方法将鼠源性抗HTNVmAb1A8的ScFv基因和人Ck基因连接，分别克隆入原核表达载体pComb3和真核表达载体pCI-neo中，并用间接免疫荧光和Western-blot检测其原核表达产物的活性。结果成功地构建了重组1A8－ScFv-Ck基因并克隆入原和真核表达载体。间接免疫荧光和Western-blot分析表明，该基因在E.coliTG1中的表达产物可与HTNV NP抗原特异性结合。结论抗NP抗原mAb的ScFv-Ck原核和真核表达载体的构建，为进一步研究细胞内抗体的功能奠定了基础。     

抗汉坦病毒NP抗原细胞内抗体的瞬时表达及活性检测

目的 :在真核细胞中表达抗汉坦病毒NP抗原鼠源性单克隆抗体 (mAb) 1A8的scFv ,并检测表达产物的活性。方法 :将真核表达载体 1A8 scFv Cκ/pCI neo用脂质体转染COS 7细胞 ,用间接免疫荧光和免疫共沉淀法检测瞬时表达产物的免疫学活性。结果 :间接免疫荧光的结果表明 ,约 1%细胞胞质中出现弥散荧光 ,在免疫共沉淀 /免疫印记中 ,表达的抗体片段可与汉坦病毒的NP抗原特异性结合。结论 :细胞内表达的1A8 scFv Cκ可与NP抗原特异性结合 ,为进一步研究细胞内抗体的抗病毒功能奠定基础     

抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达

目的 克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达.方法 从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2FA中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Westem blotting对目的蛋白进行鉴定,间接EHISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性.结果 克隆的VH基因长度为351 bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339 bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750 bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr 32 000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争HLISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性.结论 成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础.     

小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体的制备及细胞内定位的初步研究

目的:制备小鼠双尾C蛋白Bicc1的多克隆抗体并确定其在细胞内定位.方法:根据生物信息学分析结果, PCR扩增小鼠Bicc1编码61E-199A的cDNA片段.将该片段克隆到GST融合蛋白表达载体上, 在IPTG诱导下产生Bicc1-N抗原.纯化目的蛋白并制备兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体.Western blot鉴定抗体特异性, 并以间接免疫荧光法初步分析该蛋白在细胞内定位.结果:成功构建Bicc1-N片段原核表达载体, 在大肠杆菌中实现可溶性表达, 制备小鼠Bicc1蛋白的多克隆抗体, 并证实该蛋白主要表达于细胞质内.结论:成功制备了高效价并特异的兔抗Bicc1多克隆抗体, 为进一步研究Bicc1基因产物的生物功能奠定了基础.     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fab基因的克隆和表达

目的：克隆抗人肝癌单抗(mAb)HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中表达。方法：采用RT-PCR法，利用设计的引物扩增mAb Fd和κ链全长基因，并分别克隆到T载体中进行序列分析。然后，亚克隆到原核表达载体pComb3中，转化感受态大肠杆菌后以IPTG诱导表达。采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。结果：克隆了mAb HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中获得表达。竞争性ELISA和免疫荧光检测证实，表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功地构建了抗人肝癌小分子Fab抗体，为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础。     

我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.     

人类微小病毒B19结构蛋白VP2的重组表达及单克隆抗体的制备

目的：制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体（mAb）杂交瘤。方法：采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因，经克隆、测序确认后，再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB／c小鼠，制备可分泌特异性B19 mAb的杂交瘤细胞。以真核表达载体转染CHO细胞后，筛选单细胞表达克隆，将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应。结果：从患者血清标本中扩增出了1665bp长的DNA，测序结果证实为vp2基因。将该基因克隆至原核表达载体中后，在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经SDS-PAGE后，在Mr约为6000处可见1条明显的表达带。Western blot的结果表明，该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应。以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原，免疫BALB／c小鼠，经细胞融合、克降化，获得2株分泌特异性的抗VP2 mAb的杂交瘤细胞。以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应。用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清，也与筛选到的mAb呈阳性反应。结论：成功地制备抗VP2的mAb，为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗人HAbl8G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达

目的：构建抗人HAbl8G分子单链抗体基因，并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法：通过连接肽(G1y4Ser)3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAbl8轻、重链可变区基因拼接成单链抗体(ScFv)基因，并在5′和3′端引入相应的酶切位点，克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB 5His之中，转化到E.coli HB215l中进行诱导表达。亲和层析纯化表达蛋白后，以SDS-PAGE电泳、Western blot及ELISA等方法分析检测表达产物。结果：经限制性酶切鉴定及DNA测序分析，证实基因构建正确。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达。表达产物的相对分子质量(Mr)为3lkD，与理论预期值相符，并且可与相应的抗原特异结合。结论：成功实现了抗人HAbl8G分子单链抗体的原核分泌表达，为其在人肝癌诊治中的进一步应用奠定了基础。     

乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)多表位基因的在原核载体中的克隆、游离表达及其产物的抗原性.方法:设计、并合成HBV多表位抗原基因BPT, 克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA, 进而转化Top10大肠杆菌, 阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白(B-BPT), 并用Western blot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性.结果:成功构建了原核表达载体pBAD/BPT, 在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白B-BPT, Western blot 检测显示该蛋白具有良好抗原性.结论:HBV多表位抗原基因的设计是成功的, 其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性, 可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物.     

9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3 分子表达的抑制作用

目的 获得9．1C3胞内抗体基因的真核表达载体,观察胞内抗体对9．1C3分子表达的抑制作用,为进一步研究9．1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法 设计引物,以9．1C3 ScFv基因为模板进行PCR扩增,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标记的Etag序列。回收纯化PCR产物,酶切后连接到pUC19载体上,并进行序列测定。序列正确后切下胞内抗体基因片段,重组到真核表达载体pRc/CMV中,酶切鉴定后用DEAE－dextran方法瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Western blot方法检测胞内抗体的表达。接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9．1C3阳性的Jurkat细胞,用FCM观察胞内抗体对9．1C3分子表达的影响。结果 DNA序列测定证明,通过PCR成功地为9．1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E－tag序列,成功地构建了胞内抗体真核表达载体,通过胞内染色方法和Western blot证明胞内抗体在COS7中得到表达。转入Jurkat细胞后发现胞内抗体能下调9．1C3分子的表达水平。结论 以9．1C3 ScFv基因为模板PCR扩增得到9．1C3胞内抗体基因,并构建了真核表达载体。     

抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定

目的 构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体（single-chain Fv)蛋白。方法 设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50A mAb VH和VL基因间引入连结短肽,体外构建50A ScFv基因并进行序列分析;将克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性。结果 序列分析表明,50A ScFv基因全长747bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量（Mr)为29000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16．2％,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性亲和力。结论 成功地构建50A ScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础。     

重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。     

鸡C/EBP-α基因表达载体的构建及抗血清制备

目的:构建鸡C/EBP-α基因原核和真核表达载体及制备高效价的抗血清,为在蛋白质水平研究鸡C/EBP-α基因的功能以及与其他脂肪细胞分化调控基因间的时空协同关系奠定基础。方法:采用RT-PCR的方法,根据已知鸡的C/EBP-α基因cDNA序列,获取鸡C/EBP-α基因的cDNA片段,测序正确后分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中。重组质粒pGEX-4T-1/C/EBP-α转化大肠杆菌BL21(DE3),不同浓度的IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测蛋白表达情况;真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α应用水压转染法,经RT-PCR检测外源C/EBP-α基因在小鼠肝脏中的表达情况,然后采用"DNAprime-protein boost"策略免疫小鼠,制备高效价的抗血清,应用Western blot检测抗血清的特异性。结果:构建了鸡C/EBP-α基因的原核和真核表达载体;SDS-PAGE显示C/EBP-α得到了特异性的表达;RT-PCR结果提示C/EBP-α mRNA在小鼠肝脏中表达;ELISA和Western blot结果表明基因免疫小鼠产生了高效价和特异性强的抗血清。结论:成功构建了鸡C/EBP-α基因的原核pGEX-4T-1/C/EBP-α和真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α,外源基因C/EBP-α mRNA能在小鼠肝脏中有效表达,同时制备了高效价、特异性强的抗血清。     

组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-V_L-V_H,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性.方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb V_L和V_H的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-V_L-V_H,并进行酶切鉴定和测序.通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800 μg/L G418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性.结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-V_L-V_H并在CHO细胞中表达.ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25 mg/L.结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础.     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

Ficolin-A的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定

目的: 克隆小鼠ficolin-A(mouse ficolin-A)基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolin-A的功能.方法: 用RT-PCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolin-A cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达.用GST-Sepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.制备ficolin-A的多克隆抗体并对其效价进行测定.结果: 成功地构建了pVAX-1-ficolin-A真核表达载体及pGEX-KG-ficolin-A原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致.并且成功制备了多克隆抗体.结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX-1-ficolin-A及pGEX-KG-ficolin-A, 并在E.coli BL21中表达了ficolin-A蛋白, 为下一步研究小鼠ficolin-A的功能奠定了基础.