胚鼠腹侧中脑和胚肾联合移植治疗Parkinson病的实验研究

为了提高移植多巴胺(DA)能神经元的存活率和促进神经元生长,将胚鼠腹侧中脑和胚肾联合移植入Parkinson病(PD)模型大鼠脑内,检测胚肾对移植DA能神经元的影响。先用神经毒剂6 OHDA损毁大鼠左侧中脑被盖腹侧区和黑质致密部建立PD动物模型,再将胚脑的腹侧中脑(A组)、胚脑的腹侧中脑和胚肾(B组)分别移植入左侧纹状体尾壳核,C组为空白对照。于移植后3d、1月、3月将动物处死,采用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化法观察3组动物移植部位DA能神经元的存活和生长状况。在移植部位可见B组较A组的TH阳性神经元和纤维的数量明显增多,C组的移植部位未见TH阳性神经元和纤维;A、B两组的移植针道及其周围也有TH阳性神经元和纤维;B组的TH阳性神经元数量、体积和神经纤维的密度均大于A组。移植1个月和3个月后,A、B两组大鼠的旋转行为均较C组减少(P<0. 05)。以上结果提示胚肾具有良好的神经营养作用,能促进移植DA能神经元的存活和生长。     

黑质纹体系多巴胺神经元的发育与再生的关系

取不同头臀长(CRL)10～22mm(E13～18)鼠胚腹侧中脑制成悬液,分别移植至帕金森氏病模型鼠去多巴胺(DA)神经侧纹状体中。发现用CRL为10～16mm(E13～15)胚脑为供体的受移植鼠行为效应和移植区DA神经元存活情况远较以CRL为17～22mm供体为佳。用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法规察了不同胚龄(E_(13)～P_0)黑质纹体系DA神经元的形态和分布,发现CRL10～16mm(E13～15)时TH阳性细胞位于Sylvius导水管腹侧,此时DA细跑开始分化,至胚CRL17mm时TH阳性细胞已迁移至被益腹外侧,并大部分化出长突起,至出生时分化及迁移基本完成。本文讨论了DA神经元发育和其在受体脑内再生的关系。     

纹状体对体外培养中脑多巴胺神经元形态发育的影响

靶细胞在神经细胞的生长发育过程中起着重要的调节作用。本文通过胚胎腹侧中脑和纹状体联合培养研究纹状体对中脑多巴胺(DA)神经元形态发育的影响。纹状体(Str)和腹侧中脑(YMA)细胞悬液取自胚胎14天SD大鼠,联合培养3到14天后取出,用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法观察不同时期DA神经元的生长。与VMA单独培养相比,联合培养3天,发现细胞聚集程度较低,开始形成单层分布,培养7天TH阳性细胞数增加,多突起阳性细胞较易发现,细胞突起粗短,呈树枝状分枝。培养14天,TH阳性细胞数进一步增加,平均可达49个/25mm~2。本文对纹状体调节DA神经元生长发育的机制进行了讨论。     

大鼠纹状体parvalbumin阳性中间神经元的超微结构

目的:研究纹状体parvalbumin (Parv)阳性中间神经元在神经通路上的突触连接.方法:利用免疫组织化学和神经示踪方法标记SD大鼠纹状体Parv及其相关神经元,光镜和电镜观察阳性神经元的结构和位置关系.结果:Parv阳性中间神经元中等大小,散在分布于纹状体,以背外侧居多.光镜免疫双标记显示Parv阳性中间神经元与皮质、丘脑和中脑黑质的传入轴突终末形成明显的形态位置上的邻近关系,其轴突终末则与纹状体不同类型投射神经元在光镜下也形成邻近关系.Parv阳性中间神经元的免疫电镜观察显示阳性产物主要游离于胞体、树突和轴突的胞质内.Parv阳性中间神经元的胞体和树突均接受大量的非对称型突触传入.Parv阳性轴突终末平均大小为(0.62±0.28)μm,可见其与纹状体神经元的树突、胞体和树突棘形成对称型突触,其中与树突形成的突触占69.64%,与胞体和树突棘形成的突触分别为26.78%和3.58%.结论:纹状体Parv阳性中间神经元形态学上与皮质、丘脑、黑质以及纹状体投射神经元形成突触连接,提示其可能在调节纹状体信息传入和输出过程中具有重要作用.     

睾丸支持细胞与神经干细胞的分化及对帕金森病的治疗

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种缓慢发生的选择性中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元丧失和纹状体DA含量明显减少的老年神经系统退行性疾病。由于PD病变部位变性的DA神经元位置局限、主要投射区纹状体的解剖位置清楚,因此PD较适合于神经移植治疗。因为存在免疫排斥反应,胚胎神经组织移植入帕金森病患者体内存活率很低,还须从营养支持和局部免疫保护方面进行改进。睾丸支持细胞(Sertoli细胞)能够分泌许多营养、调节、免疫抑制因子,     

胚胎嗅鞘细胞和中脑腹侧细胞移植对帕金森病SD大鼠纹状体神经元存活和分化的影响

目的观察胚胎嗅球嗅鞘细胞(OECs)和胚胎中脑腹侧细胞(VMCs)联合移植对帕金森病(PD)SD大鼠纹状体神经元存活及分化的影响。方法 12只PD模型SD大鼠随机平均分成两组:单独VMCs组(在脑立体定位仪下将VMCs植入PD大鼠模型毁损侧纹状体内)和联合移植组(在脑立体定位仪下将OECs和VMCs植入PD大鼠模型毁损侧纹状体内)。OECs来源于5～7d绿荧光鼠的嗅球嗅鞘,VMCs来源于孕13～14d绿荧光胎鼠中脑腹侧的脑组织。于移植后4、14周灌注取脑,切片后做酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色,检测胚胎中脑腹侧细胞的存活及分化状况。结果移植4周后单独VMCs组及联合移植组纹状体区都可检测到TH免疫阳性神经元,数量无统计学差异(P0.05)。移植14周后联合移植组纹状体区TH免疫阳性神经元数量比单独VMCs组明显增多(P0.05)。结论胚胎中脑腹侧细胞联合嗅鞘细胞移植入帕金森病大鼠纹状体促使纹状体神经元分化为多巴胺能神经元。     

羊膜细胞对帕金森病鼠纹状体中残存多巴胺神经元的营养作用

目的：探讨非多巴胺能组织移植治疗帕金森病（PD）的作用机理。方法：通过6-羟基多巴胺（6-OHDA）立体定向流向破坏-侧黑质,制成PD大鼠模型,然后将鼠的成活羊膜细胞悬液植入受损侧纹状体,与鼠的死羊膜细胞移植及生理盐水假移植对照。结果：发现活羊膜细胞移植可减少大鼠的异常旋转行为,酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化结果显示在活羊膜细胞移植靶点周围出现了（TH）疫阳性物质。结论：说明活羊膜细胞诱导了宿主纹状体残存多巴胺（DA）神经元的再生,提示羊膜细胞能够分泌对在体DA神经元具营养作用的物质。     

胶质细胞系源性神经营养因子促进大鼠中脑多巴胺能神经元存活与分化的机制

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）促进中脑多巴胺（DA）能神经元存活和分化过程中,磷脂酰肌醇3激酶（P13K）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的可能作用.方法生后大鼠中脑脑片培养,并依培养基内加入的不同物质分为空白对照组、GDNF组、PI3K通路阻断组、MAPK通路阻断组.培养6 d后,进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色,光镜观察,计算机辅助图像分析,统计学处理;同时用Western blotting方法检测脑片中TH的表达.结果GDNF组TH表达阳性神经元的形状更趋向成熟,其TH表达阳性神经元的密度、胞体大小和TH的表达水平均显著高于空白对照组;P13K通路阻断组TH表达阳性神经元几乎消失,其TH表达水平显著低于GDNF组而与空白对照组无显著差别;MAPK通路阻断组TH表达阳性神经元的密度及TH表达水平与GDNF组无显著区别,但TH表达阳性神经元胞体显著小于GDNF组.结论P13K通路参与介导GDNF对DA能神经元的促存活作用,而MAPK通路参与介导其促形态学分化作用.     

Fluoro-JadeC染色方法显示神经毒物MPTP和红藻氨酸致小鼠中脑黑质神经元的变性死亡

为探讨Fluoro-JadeC荧光染色检测神经毒物MPTP和红藻氨酸(KA)损伤致中脑黑质神经元变性死亡的方法,本研究采用小鼠腹腔注射MPTP或黑质定位注射KA制备黑质损伤模型,然后进行Fluoro-JadeC染色标记和计数分析黑质内变性死亡神经元。结果显示:Fluoro-JadeC(FJC)染色可清晰地显示MPTP或KA致小鼠黑质损伤后出现的变性神经元,包括变性神经元的细胞胞体和突起。在中脑组织切片上,MPTP模型与KA模型黑质致密部内有许多FJC染色阳性的变性神经元,而对照组动物黑质内未见FJC染色阳性的变性神经元分布。本研究结果表明:FJC方法能够很好地显示MPTP和KA动物模型黑质内神经元的变性死亡,具备很高的对比度和分辨率,是一种特异性标记黑质变性神经元树突、轴突和胞体的优良染色方法。     

大鼠黑质—纹状体对侧投射

大鼠单侧尾壳核头部引入辣根过氧化物酶后,在同侧黑质致密部、丘脑束旁核及中缝背核内均存在大量标记细胞。对侧黑质致密部、被盖腹侧区及中脑网状结构内也可见少许阳性神经元胞体,说明黑质一纹状体对侧投射系统确实存在。通过细胞计数,我们发现对侧黑质及被盖腹侧区内标记细胞仅占同侧标记的0.81%。电镜观察发现,单侧黑质损毁鼠的损毁侧尾壳核内神经囊泡广泛破损,而其健侧尾壳核神经囊泡,电镜象与正常动物者近似,这也从另一角度印证了黑质一纹状体对侧投射成分极少这样一个事实。本实验结果可能有助于探讨黑质一纹状体对侧投射系统的机能意义。     

多巴胺能中脑——杏仁核通路

本实验用神经元逆行荧光标记和单胺荧光组化联合法研究了大白鼠杏仁核内多巴胺能神经纤维的起源及投射特点。一侧杏仁核注射荧光标记物后,同侧黑质致密部背内份和被盖腹侧区背外份有较多的多巴胺神经元被标记。黑质外侧部、A_8群所在部位及对侧黑质致密部和被盖腹侧区亦有少数多巴胺细胞被标记。同侧黑质致密部和被盖腹侧区内还观察到少数非多巴胺能逆行标记细胞。杏仁核与同侧尾壳核、伏隔核或额前皮质配对注射不同荧光标记物后,同侧被盖腹侧区与黑质致密部的背侧区与腹侧区之间有不少多巴胺神经元被逆行荧光双标记。     

GDNF激活星形胶质细胞保护PD模型大鼠黑质多巴胺能神经元

探索在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)保护受损多巴胺(DA)能神经元过程中,星形胶质细胞的可能作用。成年大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备Parkinson病(PD)模型。动物模型右侧黑质内注射GDNF,于注射后第7、14和21d进行动物行为学分析,行黑质节段连续冠状石蜡切片,以抗酪氨酸羟化酶(TH)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫组化染色,分别显示DA能神经元和激活的星形胶质细胞,光镜观察并进行细胞计数。用免疫印迹法分析注射后第21d黑质内TH、GFAP蛋白表达量,蛋白条带用图像处理仪扫描,LabWorks软件分析处理。结果显示:动物在注射GDNF后第21d,行为学功能出现显著性恢复;TH阳性神经元数量显著增加;在检测的各时间点均可观察到大量的GFAP阳性细胞;TH、GFAP的蛋白表达量显著高于对照组。以上结果提示,黑质内注射GDNF可能通过激活了的星形胶质细胞保护PD模型大鼠黑质DA能神经元。     

Ascending projections to the lateral thalamic nuclei from the substantia grisea centralis in the rat: a retrograde WGA-HRP study

Ascending projections to the lateral thalamic nuclear group from the substantia grisea centralis (SGC) were studied by injections of wheat germ agglutinin-conjugated with HRP (WGA-HRP) into the laterodorsal (LD) and lateroposterior (LP) thalamic nuclei. The present study demonstrated that the pars ventralis of the SGC at the levels of the intercollicular region and of the locus ceruleus sent fibers to both the LD and LP on both sides with homolateral predominance. Distribution pattern and morphological characteristics of the LD-projection neurons in the SGC were similar to those of SGC-LP projection cells. WGA-HRP injections into the LD or LP labeled also a considerable number of neurons in the dorsal raphe nucleus and the dorsal tegmental nucleus bilaterally with homolateral predominance, but the nucleus of Darkschewitsch contained labeled neurons only after the LD injection.     

Dorsal border periaqueductal gray neurons project to the area directly adjacent to the central canal ependyma of the C4-T8 spinal cord in the cat

In a previous study horseradish peroxidase (HRP) injections in the upper thoracic and cervical spinal cord revealed some faintly labeled small neurons at the dorsal border of the periaqueductal gray (PAG). The present light microscopic and electronmicroscopic tracing study describes the precise location of these dorsal border PAG-spinal neurons and their terminal organization. Wheat germ agglutinin-conjugated HRP (WGA-HRP) injections into cervical and upper thoracic spinal segments resulted in several hundreds of small retrogradely labeled neurons at the dorsal border of the ipsilateral caudal PAG. These neurons were not found after injections in more caudal segments. WGA-HRP injections in the dorsal border PAG region surprisingly resulted in anterogradely labeled fibers terminating in the area dorsally and laterally adjoining the central canal ependyma of the C4-T8 spinal cord. No anterogradely labeled fibers were found more caudal in the spinal cord. The labeled fibers found in the upper cervical cord were not located in the area immediately adjoining the ependymal layer of the central canal, but in the lateral part of laminae VI, VII and VIII and in area X bilaterally. Electronmicroscopic results of one case show that the dorsal border PAG-spinal neurons terminate in the neuropil of the subependymal area and in the vicinity of the basal membranes of capillaries located laterally to the central canal. The terminal profiles contain electron-lucent and densecored vesicles, suggesting a heterogeneity of possible transmitters. A striking observation was the lack of synaptic contacts, suggesting nonsynaptic release from the profiles. The function of the dorsal border PAG-spinal projection is unknown, but considering the termination pattern of the dorsal border PAG neurons on the capillaries the intriguing similarity between this projection system and the hypothalamohypophysial system is discussed.     

树黑质至上丘的γ-氨基丁酸能和多巴胺能阳性纤维投射

目的研究树嗣黑质至上丘的γ氨基丁酸(γaminobutyricacid,GABA)能和多巴胺(Depamine,DOPA)能阳性纤维投射。方法采用荧光金(Fluo-Gold,FG)逆行追踪分别与GABA和DOPA免疫组化相结合技术。结果在树双侧黑质的致密部、网状部和外侧部均观察到FG逆行标记细胞;双侧黑质的网状部除向上丘发出GABA能纤维投射外,同侧黑质网状部还向上丘发出DOPA能纤维投射。此外,在同侧黑质的致密部,还观察到少量的向上丘投射的DOPA能神经元。结论黑质向上丘的GABA和DOPA能阳性纤维投射为阐明黑质的生理功能提供形态学依据。     

黄喉鹀层状核向脑桥及中脑听性核团的投射

用HRP顺行追踪法研究黄喉鵐延髓层状核向脑桥及中脑的投射.将HRP微电泳入层状核,在同侧上橄榄核,对侧脑桥外侧丘系腹核及中脑背外侧核等处见到密集的顺行标记纤维或终末;在对侧层状核同时见到许多标记细胞和终末;在双侧巨细胞核出现了密布的逆行标记细胞.结果说明层状核投射至同侧上橄榄核,并终止于对侧的外侧丘系腹核及中脑背外侧核;双侧层状核之间有许多的往返联系.此外,层状核接受巨细胞核的传入投射.因此层状核可能是听觉上行通路中在脑干的第二级中继站.     

大鼠红核酪氨酸羟化酶、生长抑素和亮啡吠能神经元至延髓外侧网状核的研究

用HRP逆行追踪和免疫细胞化学ABC法相结合研究了红核内酪氨酸羟化酶、生长抑素和亮啡呔免疫活性神经元至延髓外侧网状核的投射.结果表明,红核内HRP标记细胞为对侧性,主要分布于其尾侧2/3,同时,还可见酪氨酸羟化酶、生长抑素、亮啡呔单标细胞及HRP/酪氨酸羟化酶、HRP/生长抑素、HRP/亮啡呔双标细胞,其中HRP/酪氨酸羟化酶双标细胞约占HRP单标细胞25.2%,HRP/生长抑素双标细胞约占21.3%,HRP/亮啡呔双标细胞约占15.4%.红核参与镇痛和心血管活动的调节可能与上述神经递质有关.     

Differential distribution of hypoxia-inducible factor 1-beta (ARNT or ARNT2) in mouse substantia nigra and ventral tegmental area

Hypoxia has been proposed as a mechanism underlying gene–environment interactions in the neurodevelopmental model of schizophrenia, and hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) could mediate the interactions. In the current study, we analyzed the HIF-1 beta subunit, as formed by aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT) or ARNT2, in the mouse substantia nigra (SN) and the ventral tegmental area (VTA). We performed immunohistochemical studies of ARNT and ARNT2 in the adult mouse brain, and colocalization analyses, with specific emphasis on dopaminergic cells, i.e. tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactive cells. Bioinformatic analyses identified shared protein partners for ARNT and ARNT2. ARNT immunoreactivity showed widespread neuronal labeling without overt regional specificity. We observed co-localization of ARNT and TH in the SN compacta and VTA. Nuclei strongly labeled for ARNT2 were observed in the SN reticulata, while only weak immunoreactivity for ARNT2 was found in TH-immunoreactive neurons in SN compacta and VTA. Stereological analysis showed that ARNT was preferentially expressed in dopaminergic neurons in SN compacta and VTA. Nuclei strongly labeled for ARNT2 were present in neocortex and CA1 of hippocampus. Differential expression of ARNT and ARNT2 in dopaminergic neurons may relate to the vulnerability of distinct dopaminergic projections to hypoxia and to functional vulnerability in schizophrenia and other neuropsychiatric disorders.     

下丘脑移植的实验形态学研究

为了探讨脑组织移植的机制,本实验对大鼠进行了实验形态学研究。用谷氨酸单钠(MSG)损毁大鼠弓状核,用15～18天鼠胚下丘脑组织移入第三脑室,存活3～5个月。然后对正常(N)组,损毁(D)组及损毁后移植(T)组动物的下丘脑和垂体前叶进行光镜、电镜和免疫细胞化学观察,对血清的睾酮进行生化测定。结果表明:MSG能选择性地损毁弓状核内约80%的神经元。第三脑室内的移植物呈团块状,能存活并与宿主脑组织紧密连接,两者之间存在交界面或直接融合。荧光显微镜下可见移植物内有发黄绿色荧光的儿茶酚胺能神经细胞,免疫细胞化学显示移植区内存在TH阳性神经细胞,后者为梭形或多角形。电镜观察表明:移植区内有神经细胞、神经纤维、各种胶质细胞和毛细血管,并且存在轴-树和轴-轴突触。免疫电镜还显示有TH阳性神经元胞体和轴突末梢,后者可作为突触前成分与TH阴性结构形成突触。此外,免疫组化显示T组垂体前叶的GH和FSH(FSH在雄性动物能促进曲细精管发育和精子生成)细胞较D组明显增多,放免分析表明T组血清中睾酮含量也比D组明显升高。本研究还证明接触脑脊液的神经元在脑组织移植中有重要作用。