华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

[目的]通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1并表达出融合蛋白.[方法]用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Dom ain Search等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析.根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上.筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定.[结果]发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43.序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域.构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符.电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带.[结论]发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因的生物信息学分析

目的分析和预测华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)基因序列结构和功能特征及其编码蛋白的理化性质,预测该基因的生物学意义。方法利用生物信息学方法(Vector NTI、InterProScan、SignalP和SecretomeP等相关软件)对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因及相应氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、信号肽、亲水性/疏水性、B细胞表位进行预测分析。结果华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因的开放阅读框包含867 bp,编码288个氨基酸,理论分子质量为35 Mr,等电点为9.16。SignalP和SecretomeP分析结果显示华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白为非经典途径分泌蛋白;InterProScan分析结果显示,华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白特征性结构域位于第45～76位,第211～267位和第1～289位氨基酸之间。在该基因的氨基酸序列中,共发现7个B细胞表位。结论利用生物信息学知识和各种分析软件对Cs NOSIP所编码的cDNA序列及理论蛋白质的理化性质、结构和功能域等进行预测和分析,能够为开展Cs NOSIP的表达及其功能研究提供理论依据。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中识别组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,为进一步的实验研究提供理论指导。方法利用生物信息学网站的在线分析工具和Vector NTI suite软件包,识别华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因,并预测其编码蛋白质的各种结构特征与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果BLASTx分析该基因为全长基因,该基因全长1,459bp,编码425个氨基酸,具有两个天冬氨酸蛋白酶的催化位点。SignalP分析该基因编码的蛋白质含有信号肽序列,切割位点在第17和第18个氨基酸之间,分子进化树提示其与日本血吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶亲缘关系最近。结论组织蛋白酶D属于天冬氨酸蛋白酶家族,为分泌性蛋白,与日本血吸虫同源基因一致性最高,为后续实验筛选华支睾吸虫病的诊断抗原及药物靶标提供了必要的理论依据。     

华支睾吸虫成虫CsRPEF基因的生物信息学分析

目的筛选华支睾吸虫的功能基因并进行相应的生物信息学分析。方法使用PCGENE软件、Antheprot-5软件、ExPASy在线分析工具、NCBI上的Blastx程序进行华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(CsRPEF)基因的生物信息学分析。结果获得了CsRPEF基因的序列特征,推测到了CsRPEF的同源蛋白并预测出CsRPEF编码蛋白的分子量、等电点、柔曲性、疏水性、功能性位点等二级结构特征。结论华支睾吸虫成虫CsRPEF基因是一新筛选的功能基因,CsRPEF蛋白是可能参与华支睾吸虫基因转录途径的重要因子。CsRPEF基因的生物信息学分析可为其进一步进行生物学功能的实验研究奠定基础。     

应用生物信息学方法筛选华支睾吸虫功能基因-Cdc42样蛋白

目的通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因,以研制华支睾吸虫的药物靶标。方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法分析EST序列。结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cdc42样蛋白基因。结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cdc42样蛋白基因。     

应用生物信息学方法筛选华支睾吸虫功能基因-Cde42样蛋白

目的 通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库，筛选其功能基因，以研制华支睾吸虫的药物靶标。方法 应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库，进行大量EST测序，然后应用生物信息学方法分析EST序列。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cdc42样蛋白基因。结论 应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cde42样蛋白基因。     

华支睾吸虫ATP合酶B亚基全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别ATP合酶B亚基,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,用以指导实验研究。方法利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Vector NT Isuite软件包,识别华支睾吸虫ATP合酶B亚基基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果Blastx分析该基因为全长基因,属于ATP合酶B亚基家族,其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp,编码300个氨基酸,含有线粒体转运肽、两个跨膜区、一个核定位序列和多个磷酸化位点,具有较稳定的理化性质。结论ATP合酶B亚基是一个理想的真核种系进化的分子标志。华支睾吸虫ATP合酶B亚基具有线粒体和细胞核的双重定位序列,提示该蛋白可能在华支睾吸虫的能量代谢途径中发挥独特的调节作用。     

佛山市南海区人群华支睾吸虫感染现况分析

目的了解南海区华支睾吸虫病感染状况及流行特点，为制定防治策略提供依据。方法用分层随机整群抽样方法抽取样本．用改良加藤氏厚涂片法粪检华支睾吸虫卵。结果共调查1137人，发现感染华支睾吸虫为263人，感染率为23．13％。男性感染率27，05％高于女性感染率19．15％（x^2=9，98，P〈0．05）；未成年组（0～15岁组）感染率3、98％低于成年组（20～岁组）感染率32．63％（X^2=16．82，P〈0．05），沙头镇人群华支睾吸虫感染率高于里水镇（X^2=143．36，P〈0．05）。结论南海区人群华支睾吸虫感染仍属高度流行区。人群华支睾吸虫感染与生产方式、生活习惯、卫生条件等密切相关，应加大宣传力度，提高人们卫生意识，改变生活、饮食习惯，以有效人群控制华支睾吸虫感染。     

江门市区人群华支睾吸虫感染状况血清学调查

目的 了解江门市区人群华支睾吸虫感染状况，为防治工作提供依据。方法 应用ELISA法检测正常人群华支睾吸虫抗体。结果共检测11767例，华支睾吸虫抗体阳性率9．77％。其中，成年人阳性率11．89％，学生阳性率8．60％，两者之间差异有统计学意义（P〈0．01）。成年人男性阳性率13．89％，女性阳性率8．90％，两者之间差异有统计学意义（P〈0．01）。学生男性阳性率8．89％，女性阳性率8．37％，两者之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 江门市属华支睾吸虫感染中度流行区。开展卫生教育，防止经口感染，对正常人群开展普查普治工作，以有效控制正常人群华支睾吸虫的感染。     

一种新型单羧酸转运体基因的分离与克隆

目的 分离、克隆编码肾脏甲酸盐（formate)和（或）草酸盐（oxalate)转运体的cDNA,以研究Cl^-在近端肾小管转运的机制。方法 根据细菌Oxlt(formate-oxalate交换体）的基因序列在哺乳动物表达序列标签（express sequence tag,EST)数据库中查找与其相似的cDNA。按筛选到的cDNA设计探针,应用小鼠多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 在小鼠肾cDNA文库中有一个与Oxlt极其相似的EST,序列分析显示了其有一编码429个氨基酸蛋白质的开放阅读框。从编码的顺序中可发现该序列与单羧酸转运家族（monocarboxylate transporter,MCT)极为相近,与小鼠MCT1的氨基酸一致性为30％,与小鼠MCT2为33％,与大鼠MCT329％。其中第14－158个氨基酸中有25％与OxlT相同。Northern印迹发现,新的基因在小鼠肾脏中表达最多,肝脏和心脏中极少表达。结论 该基因是一新型的MCT家族成员,主要在肾脏中表达,其功能可能是介导肾小管的formate转运。     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白(CsMLP)进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-CsMLP重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论 CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性,其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

华枝睾吸虫铁蛋白分子生物学特性的研究(英文)

目的华枝睾吸虫铁蛋白的表达,定位和酶特性的进行研究。方法华枝睾吸虫表达序列标志(EST)基因文库中选择克隆,作序列测定及基因分析。经酶切并重组到pRSET质粒,在E.coli BL21[DE3]pLysS菌株中表达和提纯重组蛋白,并用于鼠抗CsFtn重组蛋白免疫血清制备及亚铁氧化酶活性。结果华枝睾吸虫铁蛋白cDNA(CsFtn),具565个核苷酸,编码166个氨基酸。CsFtn核苷酸序列中含一环颈结构类似序列,与铁离子调控序列(iron-responsive element)相似。CsFtn多肽序列与其它吸虫铁蛋白有较高的序列同一性。通过基因亲远关系分析,和多种血吸虫铁蛋白的轻链位于同一簇。CsFtn重组蛋白和马铁蛋白比较,同样具有亚铁氧化酶活性,呈现铁吸收转化能力。免疫组化分析表明,CsFtn重组蛋白定位于肝吸虫成虫卵黄滤泡和虫卵内。结论CsFtn为肝吸虫卵黄铁蛋白的基因。     

人胎脑中hSNF5结合蛋白的筛选、克隆及分析

目的寻找在神经细胞中与染色质重塑复合物中hSNF5亚单位相结合的靶蛋白并探索其功能,为阐明hSNF5在细胞中参与染色质重塑复合物对靶基因调控的机制提供线索.方法以hSNF5为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选人胎脑MATCHMAKER cDNA文库.测定核苷酸序列,计算机软件分析核苷酸的同源性及功能结构域.结果获得9个阳性克隆.DNA序列分析及同源性比较表明,1个克隆的序列与推导蛋白FLJ20643羧基端的mRNA同源性高达97%,4个克隆与GenBank中可编码蛋白的序列有较高的同源性,其他4个克隆编码的氨基酸顺序与GenBank中的已知序列无同源性.结论在人胎脑cDNA文库中克隆到hSNF5的结合蛋白,这些蛋白质可能通过hSNF5募集染色质重塑复合物以调节其靶基因的转录活性,及其参与的细胞功能.     

华支睾吸虫模拟抗原表位的筛选和鉴定

目的从噬菌体12肽库中筛选华支睾吸虫模拟抗原表位。方法应用噬菌体随机12肽库亲和筛选华支睾吸虫病患者混合血清IgG,经过3轮的淘筛,随机挑取蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性,挑选免疫活性较高的克隆进行序列分析及免疫学鉴定。结果8个阳性克隆测得6个DNA序列,Western-bloting显示6个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。结论应用噬菌体肽库筛选技术可以获得华支睾吸虫模拟抗原表位。     

Cloning and characterization of a novel gene encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic reticulum

To clone and analyze the structure of a novel gene, named EST-1 (endoplasmic reticulum-localized seven-span transmembrane protein-1) and to analyze the expression pattern and intracellular location of EST-1. Methods:The cDNA library was screened to isolate novel cDNA fragment. The structure of novel gene was analysed by computer software. Expression of EST-1 was analyzed by dot blot and Northern blotting, Intracellular localization was observed after EST-1-enhanced green fluorescence protein (EGFP) fusion gene was transfected into mammalian cells. Results: The full-length cDNA of mouse EST-1 was 1 802 bp, with a 1 293 bp open reading frame encoding 431 amino acids. It was predicated that protein encoded by FST-1 contained a signal peptide sequence at the N-terminus, seven putative transmembrane domaius,and an ER-retaining signal at the C-terminus, EST-1-EGFP fusion protein showed an ER-like intracellular distribution in mammalian cells. Expression pattern analysis showed that EST-1 is expressed in all tissues examined. Conclusion: EST-1 is encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic retieulum. EST-1 was expressed in all tissues examined, suggesting an essential function of EST-1 in cells.