雷公藤内酯醇对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨雷公藤内酯醇对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过MTT法检测不同浓度的雷公藤内酯和硼替佐米单用及联用对H929细胞的增殖抑制作用;采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明:雷公藤内酯醇(10-100 ng/ml)和硼替佐米(10-100 nmol/L)单用和联用均可抑制H929细胞增殖,呈浓度依赖性,雷公藤内酯醇和硼替佐米联用组的细胞凋亡率明显高于单用硼替佐米组。经非抑制浓度的雷公藤内酯醇(10 ng/ml)联合硼替佐米(40 nmol/L)处理H929细胞24 h后的凋亡率明显高于单用硼替佐米组(P<0.05)。结论:雷公藤内酯醇能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡及分子伴侣BiP表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株NCI—H929（H929）的凋亡诱导作用及其对H929细胞中分子伴侣BiP表达的影响。以不同浓度硼替佐米处理H929细胞24小时后,采用Annexin V—FITC／PI双染联合流式细胞术检测靶细胞凋亡率;用RT—PCR和Westernblot检测靶细胞BiP mRNA和BiP蛋白的表达。结果表明：不同浓度硼替佐米（20、40、80nmol／L）均可诱导靶细胞凋亡,凋亡率分别为（15．73±0．67）％、（27．83±1．26）％7t．（44．17±2．25）％,呈剂量依赖性,且均显著高于未处理组（1．21±0．07％）（P〈0．05）;经不同浓度硼替佐米处理后,靶细胞BiPmRNA和BiP蛋白水平均高于未处理组,且二者变化一致;在相近的促凋亡条件下（凋亡率约40％-50％）,标准内质网应激诱导剂brefeldin A（500ng／ml,24小时）对H929细胞BiP mRNA和BiP蛋白表达的上调作用与硼替佐米（80nmol／L,24小时）基本一致。结论：硼替佐米诱导H929细胞凋亡并伴有分子伴侣BiP mRNA和BiP蛋白表达上调,表明硼替佐米诱导的H929细胞凋亡极可能涉及内质网应激反应。     

三氧化二砷联合硼替佐米对骨髓瘤细胞株增殖、凋亡及β-连环蛋白水平的影响

本研究探讨三氧化二砷（arsenic trioxide,AS2O3）联合硼替佐米对骨髓瘤细胞株增殖、凋亡及β-连环蛋白（β-catenin）水平的影响。硼替佐米、As2O3单用及联合处理RPMI8226、CZ-l、NCI-H929骨髓瘤细胞株48小时后,采用台盼蓝拒染法检测活细胞比例,用改良的四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测凋亡细胞比例,免疫印迹法比较用前药后β-连环蛋白的水平。结果表明：硼替佐米对RPMI8226、CZ-l、NCI-H929的半数抑制浓度（IC50）为46.9、20.7、6.8nmol/L;As2O3（1μmol/L）联合硼替佐米（5nmol/L）作用后,活细胞比例分别由88.99%、72.23%、51.06%降至54.01%、39.59%、25.00%（p〈0.05）,凋亡细胞比例由（11.1±0.1）%、（26.8±1.7）%、（36.8±5.5）%增加为（36.1±2.2）%、（60.4±3.8）%、（76±5.6）%,两组Q值介于增强与明显增强之间（1.198-3.75）。联合用药组RPMI8226、CZ-l、NCI-H929胞浆β-连环蛋白水平与单药组相比,分别下降24.15%,31.85%,33.72%。结论：As2O3能增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的增殖抑制和凋亡诱导,降低β-连环蛋白表达水平,提高骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性。     

骨髓瘤细胞系对硼替佐米敏感性与β-连环素表达水平关系的研究

目的 探讨β-连环素(β-catenin)与骨髓瘤细胞系对硼替佐米(Bortezomib)敏感性的关系.方法 以骨髓瘤细胞系RPMI8226、CZ-1、NCI-H929细胞为研究对象,采用锥虫蓝拒染法及改良四呷基偶氮唑盐比色(MTT)法检测药物对细胞的增殖抑制,Annexin V及PI染色流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响,RT-PCR及Western blot法比较硼替佐米、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)单药或联合处理后,不同细胞系胞质内β-连环素的表达及变化,分析β-连环素表达水平与骨髓瘤细胞系对硼替佐米敏感性的关系.结果 β-连环素蛋白在不同骨髓瘤细胞系的基础表达水平由高到低依次为RPMI8226、CZ-1、NCI-H929细胞,对应的硼替佐米半数抑制浓度(IC50)分别为(49.8±0.6)、(24.7±0.4)、(8.4±0.2)nmol/L;硼替佐米(0、1、5、10 nmol/L)单药处理后,各细胞系β-连环素蛋白水平呈时间、剂量依赖性升高,而相应mRNA水平无明显变化;与硼替佐米(5 nmol/L)单药处理组相比,硼替佐米(5 nmol/L)联合2ME2(1 μmol/L)处理后,RPMI8226、CZ-1及NCI-H929细胞胞质β-连环素蛋白水平分别降低64.03%、52.56%和51.48%,凋亡细胞比例分别增加8.00、1.86、1.19倍.结论 β-连环素表达水平较高的骨髓瘤细胞系对硼替佐米敏感性较低;小剂量2ME2联合硼替佐米可降低β-连环素水平,增强骨髓瘤细胞系对硼替佐米的敏感性.     

2-甲氧基雌二醇联合硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME2)联合硼替佐米的抗多发性骨髓瘤(MM)效应及与聚集小体(aggresome)形成之间的相关性.方法 以MM细胞系RPMI 8226、NCI-H929、U266、SKO-007细胞作为研究对象,采用硼替佐米单药或联合2-ME2处理,通过等效应线图法分析两者是否具有抗MM协同效应;通过免疫荧光技术在同一组细胞群中研究聚集小体阳性和阴性细胞的凋亡情况.结果 ①硼替佐米呈浓度和时间依赖性地显著提高聚集小体阳性细胞比例,且聚集小体几乎全部出现于非凋亡细胞中.②等效应线图法分析显示一定浓度范围的硼替佐米与2-ME2联合具有显著的协同作用.③硼替佐米与2-ME2联合应用后聚集小体阴性的凋亡细胞显著增多而聚集小体阳性的非凋亡细胞明显减少.在RPMI 8226及U266细胞中,硼替佐米单药与联合用药组相比,聚集小体阴性的凋亡细胞分别由(14.5±2.6)%及(20.1±2.9)%增加至(80.7±6.9)%及(71.6±6.2)%;聚集小体阳性的非凋亡细胞分别由(75.3±5.7)%及(69.1±8.6)%减少到(13.8±3.8)%及(19.5±4.2)%.结论 硼替佐米诱导生成的聚集小体对MM细胞具有保护作用;2-ME2通过抑制聚集小体途径可以显著增强硼替佐米的抗MM效应.     

硼替佐米体外诱导K562细胞凋亡的作用不受骨髓间充质干细胞的影响

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米在有或无骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells)条件下对白血病细胞株K562促凋亡作用,以及对MSC和K562细胞的黏附分子VCAM-1表达的影响.建立MSC和K562细胞的共培养体系,以终浓度为50 mnol/L的绷替佐米处理K562细胞4-24小时,应用Annexin-V/PI双染法检测K562细胞凋亡,半定量RT-PCR检测VCAM-1 mRNA的表达.结果显示,硼替佐米可诱导K562细胞凋亡,并呈现时间依赖性;共培养组调亡细胞比例与单独培养组相比无显著差异;K562细胞与MSC共培养可诱导K562细胞表达VCAM-1,MSC在共培养前后表达VCAM-1无明显变化.硼替佐米作用24小时后,K562细胞表达VCAM-1消失,MSS表达VCAM-1明显下降.结论:硼替佐米在MSC存在的情况下依然可诱导白血病细胞凋亡,提示硼替佐米可拮抗MSC对白血病细胞的保护作用.     

西达苯胺联合抗骨髓瘤药物对骨髓瘤细胞的增殖及凋亡的影响

目的:探讨西达苯胺联合抗骨髓瘤药物对骨髓瘤细胞的增殖及凋亡的影响。方法:用CCK-8法检测细胞的增殖抑制,流式细胞术检测细胞的凋亡变化。结果:西达苯胺以时间、剂量依赖性方式抑制骨髓瘤细胞的增殖(NCI-H929,r=0.720;MM.1s,r=0.636),同时促进原代骨髓瘤浆细胞的凋亡。在NCI-H929细胞系上,西达苯胺联合低剂量硼替佐米、来那度胺具有协同作用,联合地塞米松、泊马度胺具有相加作用;在MM.1s细胞系上,西达苯胺联合硼替佐米、地塞米松、来那度胺、泊马度胺均具有协同作用。结论:西达苯胺以时间、剂量依赖方式抑制骨髓瘤细胞的增殖,促进原代骨髓瘤浆细胞的凋亡,并增强抗骨髓瘤药物的抑制作用。     

三氧化二砷增强硼替佐米、地塞米松对多发性骨髓瘤细胞的作用

目的 通过观察硼替佐米单用及与三氧化二砷(As_2O_3)、地塞米松(DXM)联合应用对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3细胞增殖及凋亡的影响,探讨As_2O_3能否增强硼替佐米、DXM的抗MM作用.方法 采用MTT法检测硼替佐米单用及与As_2O_3、DXM联合应用对KM3细胞增殖的抑制作用,计算其IC_(50)值.采用细胞形态学、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段观察硼替佐米对KM3细胞凋亡的影响,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测硼替佐米联合As_2O_3、DXM后KM3细胞凋亡率的变化.结果 硼替佐米、As_2O_3及DXM对KM3细胞增殖抑制呈时间和浓度依赖性IC_(50)值分别为0.27、3.10、8.01 μmol/L;硼替佐米联合As_2O_3及DXM对KM3细胞的增殖抑制作用强于硼替佐米联合As_2_O3或DXM[(34.51±0.51)%对(25.39±0.90)%;(34.51±0.51)%对(23.80±0.78)%].0.25μmol/L硼替佐米与KM3细胞共孵育48 h后,KM3细胞出现典型的凋亡形态学改变,DNA电泳呈现梯形条带,Annexin V阳性细胞比例增高;硼替佐米联合As_2O_3、DXM组的KM3细胞凋亡率明显高于硼替佐米联合DXM组.结论 在体外,硼替佐米能够抑制KM3细胞增殖,诱导其凋亡.硼替佐米联合As_2O_3及DXM对KM3细胞增殖抑制作用显著增强;As_2O_3可增强硼替佐米、DXM对KM3细胞的诱导凋亡作用.     

硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷诱导U937细胞凋亡的研究

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷(Ara-C)对U937细胞株的作用及机制。通过细胞计数,细胞形态学检查,流式细胞术和Western blot方法检测硼替佐米(10 nmol/L)和(或)Ara-C(50 nmol/L)处理前后U937细胞的增殖抑制和凋亡及其机制。结果显示,硼替佐米和Ara-C单药均能抑制U937细胞增殖,两药联合的抑制作用更加明显,细胞增殖抑制率在24和48 h分别达(55.00±2.81)%和(70.02±3.33)%;硼替佐米联合低浓度Ara-C能协同诱导U937细胞凋亡,促使线粒体跨膜电位下降,阳性细胞率达(38.70±1.54)%。两药联合应用还能协同诱导caspase-9,-8,-3的活化。结论:硼替佐米联合低浓度Ara-C主要通过线粒体途径、可能还通过死亡受体途径诱导U937细胞凋亡。     

MEK抑制剂AZD8330对多发性骨髓瘤抗肿瘤作用的初步研究

本研究探讨MEK抑制剂AZD8330对多发性骨髓瘤细胞IM9及NCI-H929细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制.使用不同浓度AZD8330处理NCI-H929及IM9细胞48 h,用CCK-8检测细胞活力,并计算出48 h的IC50;分别用5、10及100 nmol/L的AZD8330处理上述两种细胞,然后用PI标记流式细胞术分析细胞周期的变化;Western blot方法检测细胞周期相关蛋白cyclin D及cyclin E;分别用10、100、1000及2000 nmol/L的AZD8330处理骨髓瘤细胞,AnnexinV/7-AAD双标记法分析细胞凋亡,并应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白caspase-3.结果表明,AZD8330可显著抑制NCI-H929及IM9的细胞活力,且抑制效应呈一定的时间和剂量依赖性,IM9细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）为19.88±2.7 nmol/L,NCI-H929细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）为29.3±2.03 nmol/L.细胞周期结果显示,两种骨髓瘤细胞均发生G1期阻滞;AZD8330处理后cyclin D水平显著增高,但是cyclin E水平降低,促使细胞发生G1期阻滞.AnnexinV/7-AAD结果显示,随着AZD8330浓度增加,细胞凋亡数量也相应增多,并且活化的caspase-3蛋白水平增高.结论：MEK抑制剂AZD8330可有效抑制骨髓瘤细胞NCI-H929和IM9的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进细胞发生凋亡.     

Caspase-2 functions upstream of mitochondria in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by bortezomib in human myeloma cells

Multiple myeloma is an incurable plasma cell malignancy. The 26S proteasome inhibitor, bortezomib, selectively induces apoptosis in multiple myeloma cells; however, the mechanism by which this compound acts remains unknown. Here, we, using immunoblotting analysis, observed that the expression of BiP, CHOP, and XBP-1 is up-regulated in bortezomib-induced apoptosis in human multiple myeloma cell lines NCI-H929 and RPMI-8226/S, strongly suggesting that endoplasmic reticulum (ER) stress response or the unfolded protein response (UPR), a signaling pathway activated by the accumulation of unfolded proteins within ER, is initiated. In the meantime, we also showed that bortezomib inhibited classic ER stressor brefeldin A-induced up-regulation of prosurvival UPR components BiP and XBP-1, resulting in increased induction of apoptosis in multiple myeloma cell lines, raising the possibility that bortezomib induces apoptosis of multiple myeloma cells by means of evoking the severe ER stress but disrupting the prosurvival UPR required. Using caspase inhibitors and a RNA interference approach, we finally confirmed that bortezomib-triggered apoptosis in multiple myeloma cells is dependent on caspase-2 activation, which is associated with ER stress and required for release of cytochrome c, breakdown of mitochondrial transmembrane potential, and its downstream caspase-9 activation. Taken together, these data strongly suggest that caspase-2 can serve as a proximal caspase that functions upstream of mitochondrial signaling during ER stress-induced apoptosis by bortezomib in multiple myeloma cells.     

基于IRAK4/ERK/p38信号通路雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨雷公藤红素对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响,并揭示IRAK4/ERK/p38信号通路与雷公藤红素调控H929、ARP-1细胞增殖和凋亡的关系,探究雷公藤红素联合硼替佐米是否具有协同作用.方法:采用CCK-8法检测多发性骨髓瘤细胞株H929、ARP-1细胞经不同浓度雷公藤红素、硼替佐米以及二者联用后的细胞活...     

PX-12促进硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞H929凋亡的实验研究

目的:研究PX-12对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的影响及机制。方法:以MM细胞株H929细胞为研究对象,将细胞分为PX-12组、硼替佐米组、联合组和对照组,分别加入单药PX-125.0μmol/L、单药硼替佐米20 nmol/L、两药联合和DMSO对照,培养24、48及72 h后观察细胞活性变化,通过MTT法检测MM细胞活性,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布和凋亡情况,H2DCFDA探针标记法测定各组细胞内ROS水平。结果:培养72 h后,PX-12组和硼替佐米组的H929细胞活性均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01),而联合组的细胞活性下降最为显著,且明显低于其他3组(P<0.01)。PX-12组细胞在培养48 h后,G1期的细胞数下降至40%,而S期和G2/M期数目分别上升至28%和40%,硼替佐米组细胞作用后也出现类似的分布现象,而联合组细胞经过PX-12和硼替佐米共同作用后,G1期的细胞明显下降至19%,S期细胞也降至12%,但G2/M期细胞明显上升至68%,与PX-12组和硼替佐米组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。培养72 h后,联合组细胞凋亡率达71.3%,显著高于PX-12组、硼替佐米组和对照组(20.6%、33.3%和10.6%)(P<0.01)。培养24 h后,联合组细胞内ROS水平为12015±430.2,分别高于PX-12组、硼替佐米组和对照组(6729±352.8、2651±228.3和1098±164.6)(P<0.01)。结论:PX-12可以促使硼替佐米诱导MM细胞H929凋亡增加,可能是通过ROS水平升高而导致凋亡增加。     

靶向血管内皮生长因子siRNA对K562细胞凋亡及survivin表达的影响

目的 应用腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF) siRNA沉默K562细胞中VEGF的表达,观察其对K562细胞凋亡及凋亡抑制基因survivin表达的影响.方法 应用成功构建的携带特异性VEGF siRNA的重组腺病毒(Ad5-VEGF siRNA)感染K562细胞,实验分为3组:实验组(K562/Ad5-VEGF siRNA组)、空载体组(K562/Ad5组)、对照组(K562组).通过RT-PCR法检测细胞内VEGF及survivin mRNA的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达,Western blot法检测细胞survivin蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 实验组细胞VEGF及survivin mRNA表达水平较对照组均有明显降低(P＜0.01),且细胞培养上清中VEGF蛋白表达水平[(1121±15)pg/ml]低于空载体组[(1290±28)pg/ml]和对照组[(1303±28)pg/ml](P＜0.01).Western blot法检测结果显示,实验组survivin蛋白表达水平(0.26 ± 0.11)较对照组(0.74±0.10)也显著降低(P＜0.01).实验组细胞凋亡率与对照组比较明显增加(P＜0.01).结论 应用RNA干扰沉默K562细胞中VEGF基因表达后,survivin的表达也随之降低,同时细胞凋亡率相应增加.VEGF可诱导K562细胞中survivin基因表达,可能是survivin基因表达的上游调控因子.