SARS冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:SARS 冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白 N(nucleocapsid protein)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)的制备及鉴定。方法:用基因重组的 SARS-CoV N 蛋白免疫 BALB/c 小鼠制备 McAb,并采用间接 ELISA、免疫印迹法进行筛选和鉴定。结果:筛选出2株抗 SARS-CoV N 蛋白 McAb 杂交瘤细胞株,间接 ELISA 证实这组单克隆抗体仅与 SARS-CoV 产生特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG 亚类鉴定1株为 IgG1,另1株为 IgG2b。2株抗体亲和常数分别为4.14×10~(-9)和3.19×10~(-9)。结论:获得特异性针对 SARS-CoV 的单克隆抗体,为 SARS-CoV 早期诊断试剂的研制奠定了基础。     

肝癌组织γ-谷氨酰转移酶单克隆抗体制备及ELISA方法的建立

目的应用纯化的人肝癌组织中蔓陀罗凝集素(DSA)强结合的γ-谷氨酰转移酶(GGT)制备单克隆抗体(McAb),并建立ELISA检测方法。方法应用亲和色谱法纯化肝癌组织中DSA强结合的GGT;采用单克隆抗体技术获得其McAb;protein A-Sepharose亲和色谱法纯化McAb,过碘酸钠法标记HRP法后建立ELISA方法。结果获得5株能特异性识别DSA强结合GGT的McAb细胞株,其中3株细胞所分泌McAb具有较高的特异性,应用所获得McAb进行HRP标记后,建立的ELISA方法,其检测灵敏度为10μg/L,批内及批间平均变异系数为8.9%和11.5%。结论成功制备了DSA强结合的GGT McAb杂交瘤细胞系,并建立了ELISA免疫学检测方法,为临床应用打下基础。     

丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：以基因工程表达的丙型肝炎病毒抗原蛋白（HCAg）为抗原，建立分泌单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系．并对其分泌的McAh进行鉴定。方法：用纯化HCV基因工程表达抗原（HCAg）免疫Balb／c小鼠，取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备McAb。采用ELISA及分片断鉴定技术进行鉴定。结果：筛选出5株能稳定分泌特异性抗-HC的McAb杂交瘤细胞株，经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体，特异性强，效价高。与不同抗原蛋白的ELISA反应呈特异性阳性反应。分片断鉴定结果显示，所获5株McAb主要为抗HCV核心蛋白和非结构蛋白NS3。结论：此5株丙肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丙肝抗原具有特异亲和性，为丙型肝炎病毒抗原诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体细胞系的建立及鉴定

目的 初步建立抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体规模化制备技术平台,为制备抗人细胞色素P450(CYP450)亚型蛋白的单克隆抗体奠定基础.方法 按常规方法进行细胞融合,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选杂交瘤,以ELISA、免疫组化(IH)、免疫印迹(Western Blot)、免疫沉淀(IP)对单克隆抗体加以鉴定.结果 融合后筛出杂交瘤,其分泌抗体类型为IgG1、IgG2a、IgG2b及IgM.免疫组化(IH)图片上,人肝细胞浆内均可见阳性颗粒.免疫沉淀(IP)和免疫印迹(WesternBlot)结果显示,所制备抗体与人肝微粒体蛋白有特异性结合.结论 筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌特异性较强的抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体.     

氯胺酮单克隆抗体的研制及其免疫学特性研究

目的：制备氯胺酮单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行分析。方法：采用丁二酸酐偶联法将氯胺酮（Ket）与BSA和OVA偶联合成人工完全抗原Ket—BSA和Ket—OVA,选择Ket—BSA免疫BALB／C小鼠,用Ket—OVA作包被抗原进行间接ELISA和竞争ELISA检测免疫小鼠血清效价,从而选择小鼠脾细胞为融合备用。应用杂交瘤技术制备氯胺酮单克隆抗体（Ket—McAb）,并对其效价、亲和性和特异性等进行鉴定。结果：成功地合成了氯胺酮人工完全抗原,用该抗原免疫小鼠产生高效价抗Ket抗体（1：12800）,并能被Ket单体抑制;建立了一株分泌稳定的单克隆抗体细胞株,细胞培养上清液的抗体效价为1：6400,腹水抗体效价为2×10^6;同种型为IgG2a,50％抑制浓度为80ng／ml,经鉴定能与Ket特异性结合与其它毒品类药物如冰毒、摇头丸,大麻、吗啡等无交叉反应。结论：抗氯胺酮McAb是一种特异的探针,对吸毒和戒毒病例的检测具有潜在的应用价值。     

整合素阻断剂AP25单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备整合素阻断剂AP25的单克隆抗体,鉴定其效价和特异性.方法 从抗原免疫BALB/c小鼠分离免疫脾细胞,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株并进行扩大培养.采用小鼠体内诱生法制备腹水,进行纯化后得到抗AP25单克隆抗体,用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性.结果 ELISA检测抗AP25单克隆抗体效价可达1∶2×106,Western blot鉴定抗体特异性良好.结论 获得了能够高表达抗AP25单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水制备抗体,纯化后得到效价高、特异性良好的AP25单克隆抗体.     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。     

ATP柠檬酸裂解酶鼠源单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）鼠源单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），并进行相关的特异性鉴定。方法：该研究采用原核表达的重组蛋白ACLY为抗原免疫6~8周龄Balb/c雌性小鼠，利用杂交瘤融合细胞技术构建稳定分泌ACLY McAb的杂交瘤细胞，用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光（IF）、Western-blot、免疫组织化学（IHC）、流式细胞术（FCM）等鉴定其生物活性，检测所得抗体的特异性。结果：复筛后获得了一株能稳定分泌ACLY McAb的杂交瘤细胞（5F8D11），Ig亚类为IgG1，轻链为κ链；Western-blot、IHC、IF分析和ELISA检测证实该株ACLY McAb与ACLY具有较高的特异性。结论：该株抗ACLY特异性的McAb的成功制备，为检测ACLY蛋白表达水平及研究ACLY在肿瘤及心血管疾病中的致病机制提供有力的工具，将有助于对肿瘤及心血管疾病患者制定多样合理的治疗方案。     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

用于治疗癌症病人的鼠单克隆抗体的研究

作者用癌症病人的新鲜活检组织,免疫BALB/c小鼠,制备抗肿瘤细胞表面特异性抗原决定簇的单克隆抗体(McAb).以细胞浓缩免疫荧光法(CCFIA)筛选抗肿瘤抗原阳性、但抗正常外周血白细胞(PBL)阴性的杂交细胞克隆,进一步用亲和素-生物素-过氧物酶复合物作免疫组织化学检查,鉴定其是否具有抗正常人肺、肝、肾、心脏和皮肤等组织的活性.制备周期为6～9个月,至今已制备出20株能够结合不同癌细胞表面抗     

前列腺干细胞抗原在前列腺癌中的表达及与血清PSA的关系

目的探讨前列腺干细胞抗原（PSCA）作为肿瘤标志物早期诊断前列腺癌（PCa）的可能性。并对前列腺癌患者的前列腺特异抗原（PSA）进行了检测,探讨两者之间的关系。方法采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测外周血与不同前列腺组织中PSCA的表达。结果 PSCA在BPH、PCa组织中的表达水平差异有统计学意义（P〈0.05）,在PCa组织中PSCA的阳性率随着病理分级及临床分期的增高而增加（P〈0.05）。PSCA在PSA小于或大于10ng/ml的PCa患者组织中的表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PSCA基因mRNA表达与PCa患者的分化程度和临床分期均有明显相关性。提示有可能作为一个指标对PCa患者进行早期诊断。     

前列腺干细胞抗原在前列腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨前列腺干细胞抗原(PSCA)在前列腺癌组织中的表达与病理分级、临床分期及转移关系。方法采用免疫组织化学SABC法对32例前列腺癌(PCa)和10例前列腺增生(BPH)组织中的PSCA蛋白表达进行检测,并比较各组织间表达水平的差异及其与PCa病理分级、临床分期及转移间的关系。结果PSCA在PCa、BPH组织中阳性表达率分别为87.5%(28/32)、20.0%(2/10),二者间比较有显著性差异(P<0.05),且PCa组织中PSCA表达水平与病理分级、临床分期呈正相关(P<0.05),与肿瘤转移无相关性(P>0.05)。结论前列腺癌组织中PSCA蛋白表达阳性率随着肿瘤细胞病理分级、临床分期增加而升高。PSCA是一种新的前列腺肿瘤标记物,对PCa的诊断、免疫治疗等方面有潜在价值。     

前列腺干细胞抗原在胰腺癌神经浸润转移中作用的研究

目的探讨前列腺干细胞抗原（PSCA）在人胰腺癌神经浸润中的作用。方法80例胰腺癌手术标本切片HE染色,观察记数小血管、小淋巴管、神经纤维浸润数。用鼠抗人PSCA单抗行免疫组化二步法染色,观察肿瘤细胞的阳性情况。结果肿瘤细胞神经浸润阳性与小血管、小淋巴管的浸润呈正相关（r=0．978,r=0．548,P〈0．01或P〈0．05）;肿瘤细胞PSCA表达阳性（53例）与神经浸润阳性（66例）呈正相关（r=0．746,P〈0．01）;肿瘤的恶性程度与PSCA表达呈正相关;PSCA表达与小血管、小淋巴管浸润无关。结论PSCA可能是胰腺癌的特征性分子之一。它可引导胰腺癌细胞向神经纤维趋化和黏附,即起“导航”和“停泊”作用。     

Gene expression profiling in R-flurbiprofen-treated prostate cancer: R-Flurbiprofen regulates prostate stem cell antigen through activation of AKT kinase

We have used gene expression profiling to characterize genes regulated by the anti-tumor non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID)-like agent R-flurbiprofen (RFB) in murine TRAMP prostate cancer. Mice with spontaneous, palpable tumors were treated with RFB 25 mg/(kgd) x 7d orally, or vehicle only. RNA was then extracted from tumor tissue and used for microarray analysis with Affymetrix chips. Fifty-eight genes were reproducibly regulated by RFB treatment. One of the most highly up-regulated genes was prostate stem cell antigen (psca). We used TRAMP C1 murine prostate cancer cells to examine potential mechanisms through which RFB could regulate psca. RFB induced dose-dependent expression of PSCA protein, and activity of the psca promoter, in TRAMP C1 cells in culture. Increased psca promoter activity was also seen following treatment of cells with sulindac sulfone, another NSAID-like agent, but not with celecoxib treatment. RFB activation of the psca promoter could be attenuated by co-transfection of dominant-negative akt and h-ras constructs, but not by dominant-negative mek1 plasmids. Immunoblotting revealed that RFB increased expression of phosphorylated AKT at concentrations that stimulated psca promoter activity, and that increased PSCA protein expression. In addition, RFB-dependent up-regulation of PSCA protein expression could be blocked by AKT inhibitors. These data demonstrate that RFB, and possibly other NSAID-like analogs, can increase expression of the psca gene both in vivo and in culture. They further suggest the utility of combining RFB with AKT inhibitors or with monoclonal antibodies targeting PSCA protein, for treatment or prevention of prostate cancer.     

前列腺特异膜抗原基因的表达

目的克隆前列腺特异膜抗原（PSMA）基因的编码区序列,构建PSMA真核表达载体。方法用RT．PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMAeDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0。用脂质体转染法,把pcDNA3．0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达。结果两条引物之间的片断长度为2279bp,与预期长度一致。将克隆的编码区序列与Genebank的PSMA序列同源性为99．7％;表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100kD。结论扩增PSMA编码区序列,可构建PSMA真核表达载体,建立PSMA稳定表达的细胞株。PSMA具有良好的抗原性。     

抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用

目的：抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用。方法：以碳化二亚胺法将钙调素-卵清蛋白偶联物作为免疫原，采用常规免疫方法免疫BALB/c小鼠，杂交瘤技术制备抗牛脑钙调素单克隆抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)检验，应用硫酸铵盐析法进行了抗体的纯化。结果：采用免疫印迹、免疫酶斑点法及液相竞争法鉴定了抗钙调素单克隆抗体的性质，表明该抗体对钙调素有较强的特异性。结论：此研究制备出的高特异性、高亲和力及高效价的抗牛脑钙调素单克隆抗体可用于胞外钙调素促进皮肤创伤修复的基础研究，也可用于免疫学定量分析、免疫学定位分析及共沉淀分析，具有较好的经济价值。     

前列腺干细胞抗原在人子宫内膜样腺癌组织中的表达及意义

目的探讨前列腺干细胞抗原（PSCA）在人子宫内膜样腺癌内膜组织中的表达及与临床病理学特征的关系。方法采用免疫组化、荧光定量RT—PCR和Western Blot方法检测子宫内膜腺上皮细胞中PSCA的表达。结果PSCA在内膜样腺癌组织主要表达于癌细胞，细胞间质和肌肉组织均无表达。从单纯性、复杂性到不典型增生，PSCA在mRNA、蛋白水平上的表达评分均有逐渐增多趋势，不典型增生与前二者相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。在内膜样腺癌中，随着分化程度的降低、分期的增加和浸润深度的增加，PSCA mRNA、蛋白表达逐渐增加。在增生期和分泌期PSCA的表达差异无统计学意义。PSCA表达水平与临床分期、病理分级和浸润深度均有相关性（P〈0．05）。结论PSCA是一个新的细胞表面抗原，可能参与了癌前病变的发生，其表达水平在一定程度上反映了内膜样腺癌的生物学行为，并介导了内膜样腺癌的发生与发展，可能在内膜样腺癌诊断、免疫治疗等方面具有广阔的应用前景。     

氯霉素单克隆抗体的制备与纯化

目的制备氯霉素(CAP)单克隆抗体。方法用人工合成抗原氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体,用间接竞争ELISA法和间接ELISA测定抗体特异性。结果得到两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-4以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,回收率达80%,抗体活性好并且与BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等无交叉反应。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,对动物性食品中CAP的检测具有较大的价值。