KLF4 在弥漫性大B 细胞淋巴瘤组织中的表达及其作用机制研究

目的:探讨KLF4在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中的表达及其对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及作用机制。方法:选择弥漫性大B细胞淋巴瘤石蜡组织标本60例和淋巴结反应增生患者的淋巴结石蜡组织标本60例,免疫组化法测定组织中KLF4表达。Western blot和RT-PCR测定弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系ly1细胞和人B淋巴母细胞系HMy2.CIR细胞中KLF4蛋白、mRNA水平。ly1细胞分为空白对照组(不转染病毒)、阴性对照组(转染阴性对照病毒)和过表达KLF4组(转染过表达KLF4病毒),Western blot和RT-PCR测定ly1细胞中KLF4蛋白、mRNA水平,CCK-8测定转染后ly1细胞增殖情况,Transwell小室法测定转染后ly1细胞侵袭和迁移能力,Western blot法测定转染后三组ly1细胞Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白水平。结果:弥漫性大B细胞淋巴瘤组织B细胞中KLF4阳性表达率(30.0%)低于对照组织B细胞(100.0%)(P0.05)。ly1细胞中KLF4蛋白和mRNA水平低于HMy2.CIR细胞(P0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较,过表达KLF4组ly1细胞中KLF4蛋白和mRNA水平升高(P0.05),A值降低(P0.05),侵袭和迁移细胞数降低(P0.05),p-Akt、p-PI3K蛋白水平降低(P0.05),空白对照组和阴性对照组ly1细胞中各指标比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中KLF4水平降低,过表达KLF4可能通过PI3K/Akt信号通路抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖和侵袭迁移。     

食管鳞癌中Klf17蛋白表达及其对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨KLF17与临床病理特征的关系;探讨KLF17对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法采用免疫组化法,检测KLF17在食管鳞癌及癌旁正常食管上皮中的表达;构建KLF17慢病毒过表达载体感染Eca109细胞,细胞分组为转染组(CON)、空载体转染组(Ad-GFP)和慢病毒转染组(Ad-KLF17)。Real timePCR检测KLF17 mRNA的表达、Western blot检测KLF17、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达;细胞划痕实验及体外Transwell实验观察Eca109细胞迁移和侵袭能力。结果 KLF17蛋白表达与侵袭深度、TNM分期显著相关(P0.05);real time-PCR及Western blot结果显示Ad-KLF17组KLF17及上皮标志物E-cadherin表达明显高于Ad-GFP组及对照组(P0.05),而间质标志物N-cadherin表达明显低于Ad-GFP组及对照组(P0.05);划痕实验与体外Transwell实验结果显示Ad-KLF17组细胞迁移距离及细胞数量明显短于和少于Ad-GFP组和对照组(P0.05)。结论 KLF17能抑制Eca109细胞发生上皮-间质转化,与其迁移、侵袭能力相关。     

RNAi介导的pirin低表达降低了K562细胞的红系分化能力

目的 研究pirin低表达对人红白血病细胞系K562红系分化和细胞活力的影响.方法 通过短发卡RNA(shRNA)干扰技术,构建pirin低表达细胞稳定株,用Western blot方法对干扰效果进行检测,并用联苯胺染色和MTT法分别检测下扰pirin后对K562细胞的红系分化和增殖的影响.结果 转染了pirin-shRNA的细胞其pirin的表达量明显低于对照组(随机干扰组),pirin低表达与对照组相比对细胞增殖无影响,但在诱导剂诱导分化过程中,血红蛋白的合成出现了显著性的降低(P＜0.05).结论 Pirin低表达不影响K562细胞的增殖能力,但能降低其红系分化能力.     

miR-320调节人慢性髓系白血病细胞系K562的增殖

目的探讨miR-320对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和细胞周期的影响。方法采用正常人及初诊的慢性髓系白血病患者外周血病单个核细胞,用实时定量PCR检测miR-320和β-catenin mRNA的表达;用miR-320模拟物转染K562细胞,CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞周期;双荧光报告基因试验和Western blot检测β-catenin mRNA表达;实时定量PCR检测miR-320模拟物对Wnt/β-catenin信号通路下游基因的转录。结果 miR-320在慢性髓系白血病患者中的表达水平显著低于正常人,而β-catenin表达水平显著高于正常人(P0.05);过表达miR-320可以抑制K562细胞的增殖(P0.05)和细胞周期的运行;miR-320可抑制靶基因β-catenin的表达,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路下游基因c-Myc、cyclin D、VEGF和Cox-2 mRNA的表达(P0.05)。结论 miR-320通过调节β-catenin的表达,在慢性髓系白血病中发挥抑癌功能。     

微小RNA miR-181a促进慢性粒细胞白血病K562细胞分化

目的探讨微小RNA miR-181a对慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞的作用。方法构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,采用实时定量PCR方法检测CD235a和γ球蛋白的表达,评价K562细胞向红系分化的程度,检测CD61和CD41的表达,评价K562细胞向巨核系分化的程度,采用CCK实验检测细胞增殖情况。结果氯高铁血红素佛及波酯诱导后,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a、γ球蛋白、CD61和CD41的表达水平(P0.05);miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(P0.05)。结论 miR-181a过表达促进K562细胞的分化并抑制其细胞的增殖。     

RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

miR-150通过调节c-Myb抑制人慢性髓系白血病细胞系K562增殖

目的探讨miR-150在人慢性髓系白血病细胞系K562中的功能和作用机制。方法以临床收集的慢性髓系白血病患者、和健康人外周血中的单个核细胞为实验材料;实时定量PCR检测miR-150和c-Myb mRNA的表达水平;使用miR-150模拟物转染K562细胞;通过CCK-8法检测K562细胞增殖;通过流式细胞计量术检测K562细胞周期;荧光素酶报告基因实验结合Western blot检测miR-150对其下游靶基因c-Myb的调控作用。结果慢性髓系白血病患者与健康人相比,miR-150表达降低,而c-Myb表达升高;过量表达miR-150可以抑制K562细胞的增殖(P0.05),同时,阻滞K562细胞周期的运行;miR-150可以下调靶基因c-Myb的表达。结论 miR-150在慢性髓系白血病中表达下调,其作用机制是通过抑制癌基因c-Myb的表达抑制白血病细胞的增殖。     

β-arrestin1激活STAT3信号通路影响白血病细胞K562体外迁移侵袭能力

目的:探讨β-arrestin1对白血病细胞生物学功能的影响及相关机制的研究。方法:特异性的β-Arrestin1-siRNA和阴性对照siRNA转染K562细胞,形成β-Arrestin1-siRNA组、阴性对照siRNA组和空白组对照组。以此为实验分组,应用transwell小室法检测各组细胞的迁移侵袭能力变化,Western blot检测p STAT3蛋白的表达。结果:β-Arrestin1-siRNA处理组细胞的迁移和侵袭能力较对照组分别下降43%及52%(P0.05);且p STAT3蛋白表达减少;STAT3抑制剂能抑制K562细胞体外迁移侵袭能力。结论:白血病细胞K562中β-arrestin1蛋白高表达激活STAT3信号通路,从而促进细胞的迁移侵袭能力。     

苦参碱通过TLR3下调PI3K/Akt通路抑制子宫肌瘤细胞的增殖、侵袭和迁移北大核心CSCD

目的:探讨苦参碱抑制子宫肌瘤细胞凋亡、侵袭和迁移的机制。方法:将子宫肌瘤细胞分为对照组(不做任何处理)、苦参碱低、中、高剂量组(分别用0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦参碱处理)、pcDNA3.1/TLR3质粒(TLR3)+高剂量苦参碱组(2.0 mg/ml苦参碱处理)、NC组(转染空质粒+2.0 mg/ml苦参碱处理)。RT-qPCR检测各组细胞TLR3、PI3K mRNA表达;CCK-8法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕实验检测各组细胞迁移;Transwell检测各组细胞侵袭能力;Western blot检测各组细胞TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果:与对照组相比,苦参碱低、中、高剂量组TLR3 mRNA、PI3K mRNA、TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9表达及细胞增殖、迁移和侵袭能力降低,凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与苦参碱高剂量组相比,TLR3+苦参碱高剂量组TLR3 mRNA、PI3K mRNA、TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9表达与细胞增殖、迁移和侵袭能力提高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05),TLR3-NC+苦参碱高剂量组与苦参碱高剂量组TLR3 mRNA、PI3K mRNA、TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9表达、细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论:苦参碱通过下调TLR3表达下调P13K/Akt通路,抑制子宫肌瘤细胞增殖、侵袭和迁移。     

STAT3调控P13K/Akt信号通路对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响北大核心CSCD

目的：探讨信号转导和转录激活因子3(STAT3)对食管癌EC106细胞增殖、侵袭和迁移的调控作用以及相关蛋白表达变化。方法：利用STAT3 shRNA慢病毒载体和STAT3过表达慢病毒载体干扰食管癌EC106细胞中STAT3表达。将细胞分为对照组、沉默组和过表达组，采用CCK-8法检测细胞增殖差异，流式细胞术观察细胞周期变化，细胞划痕实验和Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。使用RT-PCR检测STAT3、P13K和Akt mRNA表达水平，通过Western blot检测Ki67、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。结果：与对照组相比，沉默组的细胞增殖显著降低（P<0.05），而过表达组的细胞增殖增加。流式细胞术显示，与对照组相比，沉默组细胞的细胞周期在G0/G1期阻滞（P<0.05），而过表达组S期细胞增加。此外，细胞划痕实验结果表明，沉默组细胞的迁移能力显著下降（P<0.05），而过表达组细胞的迁移能力增强。Transwell实验结果显示，沉默组细胞的侵袭能力明显减弱（P<0.05），而过表达组细胞的侵袭能力增强；RT-PCR结果显示，与对照组相比，沉默组细胞中STAT3、P13K、Akt mRNA含量显著降低（P<0.05），过表达组STAT3、P13K、Akt mRNA含量显著增加；Western blot分析结果表明，相对于对照组，沉默组细胞中Ki67、PCNA和Vimentin蛋白相对表达水平明显降低，E-cadherin表达显著升高，过表达组Ki67、PCNA及Vimentin蛋白相对表达增加，E-cadherin表达显著降低（P<0.05）。结论：STAT3对食管癌EC106细胞的存活具有重要作用，沉默STAT3表达后，P13K、Akt表达下调，细胞周期进程阻滞，细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制。     

KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响

目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法:Western blot法检测KLF4在结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中的表达。将SW480细胞分为pc DNA3. 1组(转染pc DNA3. 1空质粒)、pc DNA3. 1-KLF4组(转染构建的pc DNA3. 1-KLF4过表达质粒)和pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组(转染pc DNA3. 1-KLF4 48 h后用1 mg/L顺铂处理细胞48 h),Western blot检测KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)的蛋白水平; CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率; DCFH-DA探针检测活性氧簇(ROS)含量。结果:KLF4在结直肠癌细胞中的表达均显著低于在人结肠黏膜上皮NCM460细胞的表达(P 0. 05)。与pc DNA3. 1组相比,pc DNA3. 1-KLF4组的KLF4蛋白表达显著增高(P 0. 05),细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著增高;而pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著低于pc DNA3. 1-KLF4组,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著高于pc DNA3. 1-KLF4组(P 0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低肿瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,增强顺铂化疗敏感性,其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号关键分子IκBα的磷酸化水平有关。     

微小RNA-4286调控肌醇多聚磷酸-4-磷酸酶Ⅰ型对胃癌细胞系HGC-27生长、迁移及侵袭的影响

目的 探讨微小RNA-4286（miRNA-4286）调控肌醇多聚磷酸-4-磷酸酶Ⅰ型（INPP4A）对胃癌细胞系NGC-27生长、迁移及侵袭的影响。 方法 将胃癌HGC-27细胞分为空白对照组和阴性对照组、干预组,空白对照组不作任何处理,阴性对照组转染pEGFP-N1质粒,干预组转染pEGFP-N1-miRNA-4286质粒,采用Real-time PCR检测3组胃癌HGC-27细胞miRNA-4286表达量,采用Western blotting检测3组胃癌HGC-27细胞中INPP4A蛋白表达量,采用八肽胆囊收缩素（CCK8）法检测3组胃癌HGC-27细胞增殖率,采用Transwell小室侵袭实验检测3组胃癌HGC-27细胞侵袭能力,采用划痕实验检测3组胃癌HGC-27细胞迁移能力。 结果 干预组miRNA-4286表达量、增殖率、穿过小室膜的HGC-27细胞数明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）;干预组INPP4A蛋白表达量、划痕伤口愈合间距明显低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）;阴性对照组miRNA-4286表达量、INPP4A蛋白表达量、增殖率、穿过小室膜的HGC-27细胞数、划痕伤口愈合间距较空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 MiRNA-4286可能通过下调INPP4A表达而促进胃癌细胞系HGC-27生长、迁移及侵袭。     

miR-138-5p靶向HIF-1α影响人白血病K562细胞增殖和侵袭转移

目的探索miR-138-5p与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人白血病K562细胞增殖和侵袭转移的影响。方法以体外培养的人白血病K562细胞为研究对象,将其分为K562组、miR-138 mimic组、pc-HIF-1α组和mimic+pc-HIF-1α组。荧光素酶报告实验确认miR-138-5p与HIF-1α的靶向关系;qRT-PCR法检测miR-138-5p和HIF-1α的mRNA水平;Western blot检测HIF-1α的蛋白水平;CCK-8检测细胞存活率;Transwell检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Western blot检测增殖和上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达水平。结果miR-138-5p能靶向HIF-1α,与K562组相比,miR-138 mimic组HIF-1α的mRNA和蛋白水平均显著较低(P<0.01),而pc-HIF-1α组HIF-1α的蛋白水平则显著较高(P<0.01);同时,与pc-HIF-1α组相比,mimic+pc-HIF-1α组HIF-1α的蛋白表达显著较低(P<0.01)。与K562组相比,miR-138 mimic组细胞增殖倍数、细胞迁移和侵袭能力均显著较低(P<0.01),pc-HIF-1α组则显著较高(P<0.01);与pc-HIF-1α组相比,mimic+pc-HIF-1α组细胞增殖倍数、细胞迁移和侵袭能力均显著较低(P<0.01)。同时,mimic+pc-HIF-1α能部分逆转pc-HIF-1α对肿瘤细胞增殖和EMT能力的上调作用(P<0.01)。结论miR-138-5p可通过靶向HIF-1α,进而降低人白血病K652细胞增殖和侵袭转移能力。     

FoxO1 基因对Jurkat 细胞FoxO1-KLF2-S1P1 通路的调节作用

目的:通过构建FoxO1 表达和干扰慢病毒载体,建立细胞内FoxO1-KLF2-S1P1 信号通路调控研究模型,观察FoxO1 过表达、干扰表达在Jurkat 细胞内对其下游分子表达及功能的影响。方法:构建FoxO1 表达和干扰表达慢病毒载体,分别感染Jurkat 细胞,采用荧光定量PCR、Western blot 和流式细胞术检测S1P1、CD62L、CCR7、CD69 mRNA 水平和蛋白分子的表达。结果:FoxO1 过表达组于感染后120 h FoxO1、KLF2、S1P1 和CD62L mRNA 水平显著增高(P<0.05),FoxO1、FoxO1-p 和KLF2 胞浆蛋白水平增高,S1P1+细胞和CD62L+ 细胞比率增高(P<0.05),CCR7+ 细胞和CD69+ 细胞未见显著改变(P>0.05)。FoxO1 干扰组于转染后120 h FoxO1、KLF2、S1P1 和CD62L mRNA 水平降低(P<0.05),FoxO1、FoxO1-p 和KLF2 胞浆蛋白水平低于对照组,S1P1+细胞百分比增多(P<0.05) ,但S1P1+细胞和CD62L+细胞在72 h 时减少(P<0.05)。结论:FoxO1 表达和干扰慢病毒载体转染Jurkat 细胞并调节KLF2、S1P1 和CD62L 等分子的表达,为开展细胞内FoxO1-KLF2-S1P1 信号通路调控和细胞相关功能的研究打下了基础。     

小干扰RNA下调白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白的表达及其对化疗药物敏感性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)下调白血病MOLT-4、HL-60、K562细胞的白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达对化疗药物敏感性的影响.方法 采用实时荧光定量PCR和Western免疫印迹检测MOLT-4、HL-60、K562细胞及健康人外周血单个核细胞(PBMC)XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.用NucleofectorTM核酸转染仪对高表达XIAP的K562细胞转染XIAP siRNA(实验组),同时以转染无同源性siRNA作阴性对照组,未转染任何siRNA的K562细胞作空白对照组,并检测3组细胞XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.同时将实验组、阴性及空白对照组细胞暴露于不同浓度的依托泊苷(vp-16,0.01、0.1、1、10、100mg/L)及阿糖胞苷(Ara-c,0.1、1、10、100、1000、10 000mg/L),用CCK-8法检测细胞抑制率变化.结果 与健康人PBMC比较,MOLT-4、HL-60、K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达均增高(均P＜0.05),其中K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达水平最高,与MOLT-4、HL-60细胞比较差异有统计学意义(均P＜0.05).K562细胞转染XIAP siRNA48 h后,与阴性对照组、空白对照组比较,实验组细胞XIAP mRNA及蛋白表达水平均明显下降(mRNA:0.37±0.10比1.41±0.13比1.00±0.12,蛋白:0.37±0.03比0.99±0.08比0.98±0.07,均P＜0.05).在给予1 mg/L vp-16、10及100 mg/L的Ara-c后,实验组细胞抑制率与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(均P＜0.05);在给予其他浓度vp-16和Ara-c后,3组细胞抑制率差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 XIAP siRNA能特异性下调K562细胞XIAPmRNA和蛋白质水平的表达,增强K562细胞对化疗药物依托泊苷、阿糖胞苷的敏感性.     

膜联蛋白A5低表达对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨膜联蛋白A5(ANXA5)低表达对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法将细胞分为干扰组、阴性对照组、转染试剂对照组和空白对照组,采用脂质体转染法将siRNA转染干扰组HeLa细胞,在转染72h后采用RT-PCR和Western blotting检测各组ANXA5的表达以鉴定抑制效率;细胞划痕实验检测各组HeLa细胞的迁移能力;Transwell实验检测各组HeLa细胞的侵袭能力;RT-PCR和Western blotting分别检测ANXA5低表达对E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA及蛋白表达的影响。结果干扰组ANXA5蛋白及mRNA的表达均明显低于阴性对照组(P0.05);其表达均被显著抑制,干扰组细胞的迁移及侵袭能力比阴性对照组明显增强(P0.05),E-cadherin mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组(P0.05);干扰组MMP-9mRNA及蛋白的表达均显著高于阴性对照组(P0.05)。结论靶向ANXA5的siRNA可有效抑制ANXA5的表达,且ANXA5低表达可能通过影响E-cadherin和MMP-9的表达来促进HeLa细胞的迁移和侵袭能力。     

阿霉素对K562细胞凋亡及FAK mRNA的影响

目的探讨阿霉素体外作用于K562细胞后,观察其对细胞增殖的影响,促进细胞凋亡情况,以及调节细胞周期和粘着斑激酶（FAK）mRNA基因,进一步探讨通过调控FAK表达,研究抗白血病的作用机制。方法应用细胞增殖实验（CCK8法）观察不同浓度阿霉素作用不同时间对K562细胞增殖的影响,应用流式细胞仪观察不同浓度阿霉素对K562细胞细胞凋亡,细胞周期的影响,应用RT-PCR和Western blot技术检测不同浓度阿霉素作用对K562细胞36h后FAK mRNA以及蛋白表达水平的变化。结果随着阿霉素浓度增加及作用时间延长,K562细胞的增殖抑制率逐渐升高,同一时间不同浓度之间比较,或者同一浓度不同时间组之间比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率也逐渐增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞周期阻滞,多停留在S期;阿霉素能引起K562细胞FAK mRNA表达显著降低。阿霉素能引起K562细胞FAK蛋白表达水平的降低。结论阿霉素抑制分裂期细胞的增殖,诱导细胞凋亡增加,对细胞FAK基因和蛋白水平均显著下调,为进一步研究FAK基因表达的调控与肿瘤细胞凋亡的分子机制提供了实验基础。     

siRNA沉默RALA基因影响人白血病K562细胞增殖和凋亡

目的: 研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral 猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表达对人慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法: 利用Lipofectamine^TM 2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RALA siRNA对K562细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对K562细胞存活率的影响;real-time PCR检测RALA mRNA表达水平;Western blotting检测RALA蛋白表达水平;annexin V/PI双染流式 细胞仪检测RALA siRNA对K562细胞凋亡的影响;Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态学变化。结果: RALA siRNA可明显抑制K562细胞内RALA mRNA和蛋白的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,转染RALA siRNA的K562细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);流式细胞术结果显示转染RALA siRNA的K562细胞凋亡较阴性对照组显著增加(P<0.05);Hoechst 33258染色见转染RALA siRNA的K562细胞出现典型的凋亡形态学变化。结论: 癌基因RALA在白血病发生发展过程中发挥重要作用。siRNA下调RALA mRNA和蛋白的表达,可抑制人白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示RALA可能是白血病治疗的新靶点。     

lncRNA COLCA1/miR-423-5p/FAM172A分子轴对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖和迁移的影响

目的探讨长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)COLCA1在皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)组织中的表达及其对细胞增殖和迁移的影响、分子机制。方法采用qRT-PCR法检测COLCA1在正常皮肤组织和CSCC组织、细胞系及人角质形成细胞系中的表达;选择表达最低的细胞系,分别转染空白质粒(对照组)或COLCA1过表达质粒(实验组);采用MTT法和细胞划痕实验分别检测过表达COLCA1对CSCC细胞系增殖和迁移的影响;通过生物信息学法预测COLCA1潜在的分子机制。采用qRT-PCR和Western blot法检测过表达COLCA1对靶基因表达的影响。结果 CSCC组织中COLCA1的表达显著低于正常皮肤组织(1.01±0.20 vs 5.71±0.78,P<0.01)。CSCC细胞系中COLCA1的表达显著低于人角质形成细胞系(P<0.01),A431细胞系中的表达最低(P<0.01)。与对照组相比,过表达质粒可有效促进COLCA1的表达(1.00±0.04 vs 9.31±0.99,P<0.01)。过表达COLCA1可抑制A431细胞的增殖能力和迁移能力(P均<0.01)。COLCA1可能与miR-423-5p互补结合,miR-423-5p可能与FAM172A mRNA互补结合。与对照组相比,过表达COLCA1可抑制A431细胞中miR-423-5p的表达(1.00±0.05 vs0.20±0.05,P<0.01),并促进FAM172A在mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论 COLCA1在CSCC组织和细胞系中呈低表达,过表达COLCA1可能通过miR-423-5p/FAM172A分子轴抑制CSCC细胞系A431的增殖和迁移能力。     

抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及其机制

目的 探讨抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制。方法 培养人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞,分为空白组、阴性对照组(NC组)、miR-218组;空白组未予以任何处理,NC组转染阴性对照序列,miR-218组转染miR-218抑制剂。各组细胞处理后继续培养5 d,然后收集细胞,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染后各组细胞miR-218的表达情况,采用WST-1细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验检测转染后各组C4-2细胞增殖、活性情况,采用划痕实验检测各组C4-2细胞迁移距离,采用Transwell小室检测细胞侵袭数量和迁移数量,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测TOB1基因mRNA表达情况,采用Western blot检测TOB1基因蛋白表达情况。结果 qPCR结果显示:转染后NC组、miR-218组人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的相对表达量分别为1.02±0.06、0.38±0.04,miR-218组中miR-218的表达明显低于NC组,差异有统计学意义(t=15.372, P＜0.05)。WST-1细胞增殖实验结果显示:(1)转染后空白组、NC组随着时间的延长,光密度(OD)值呈上升趋势,而miR-218组OD值在24、48 h时呈上升趋势,72 h时OD 值开始明显下降;(2)空白组、NC组、miR-218组组间比较,OD 值在0、24 h时3组间差异均无统计学意义(P值均＞0.05),48、72 h时miR-218组OD 值均小于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=12.615、24.523,P值均＜0.05)。细胞平板克隆形成实验结果显示:转染后空白组、NC组和miR-218组克隆形成数分别为(42.2±1.2)个、(41.3±2.4)个、(20.6±1.2)个,miR-218组明显少于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=155.530,P＜0.05)。划痕实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验结果显示:转染后,miR-218组细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数均低于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=17.625、48.625、38.352,P值均＜0.05);而空白组和NC组间细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数比较,差异均无明显统计学意义(P值均＞0.05)。RT-PCR和Western blot检测结果显示:转染后空白组、NC组、miR-218组TOB1基因mRNA的相对表达量分别为 0.20±0.02、0.19±0.03、0.35±0.02,TOB1基因蛋白的相对表达量分别为0.22±0.01、0.23±0.02、0.68±0.02,miR-218组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平均明显高于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=18.615、22.523,P值<0.05);而空白组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平与NC组比较,差异均无统计学意义(P值>0.05)。结论 抑制人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的表达,可抑制该细胞的增殖和活性,并抑制其侵袭和迁移能力,其机制可能与上调TOB1基因mRNA和蛋白表达有关。