旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定

目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3）后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。     

旋毛虫与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP的原核表达与鉴定

目的对旋毛虫(Trichinella spiralis)与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP进行原核表达,对表达产物进行鉴定及反应原性分析。方法利用抗MG-63细胞全蛋白抗血清筛选旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库得到旋毛虫TCTP基因。PCR扩增TCTP基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-TCTP,转化入感受态细胞BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及反应原性。结果经酶切鉴定和测序鉴定,重组质粒pET-32a (+)-TCTP构建正确。SDS-PAGE检测重组蛋白TCTP在原核表达系统中主要以可溶性形式表达,融合蛋白的相对分子质量约为43×10~3。Wetern blot检测重组蛋白TCTP可被抗MG-63细胞多抗血清识别。结论成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TCTP,表达的重组蛋白TCTP具有反应原性,为该蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

一种克隆化马来丝虫抗原在微丝蚴血症小鼠模型中的保护性效应

作者曾报道由马来丝虫表达文库筛选出一株1800bp的cDNA克隆,此克隆编码的548个氨基酸蛋白相当于马来丝虫微丝蚴(mf)的62kDa抗原,与保护性mf抗原有关。本文报告了该重组蛋白在微丝蚴血症小鼠模型中的保护性效应、免疫原性和虫期特异性。     

犬恶丝虫钙结合蛋白的分子特性

本研究运用犬恶丝虫(Dirofilaria immi-tis)第四期幼虫构建cDNA表达文库,并以第三期幼虫免疫兔制备的多抗进行筛选,从中筛选出一段非常类似于编码钙网蛋白(calreticulin)家族蛋白的cDNA片段。把该片段克隆至pTrcHisB载体,转化到TOP10株大肠杆菌表达融合蛋白。用重组蛋白制备的兔血清来检测虫体是否天然表达钙网蛋白以及运用免疫组化实验进行抗原定位。     

伪旋毛虫21 kDa蛋白的分子克隆和特性

伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)是广泛寄生于脊椎动物骨骼肌细胞的旋毛虫形线虫属的一种。幼虫寄生时无包囊形成,且病理损害涉及到肌细胞的全长。幼虫的排泄、分泌物(ES)是引起肌细胞变性的原因之一。目前对伪旋毛虫幼虫ES的抗原成份了解尚少,为此作者用ES免疫血清从伪旋毛虫幼虫cDNA文库中筛选出一重组蛋白,并对其免疫学特性进行了鉴定。 收集伪旋毛虫幼虫的ES并制备幼虫的     

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的构建及免疫学筛选

目的 构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因。 方法 在无RNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸［oligo（dT）］为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将cDNA分子定向克隆至具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体。用噬菌体包装蛋白对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转化大肠埃希菌（Escherichia coli）ER1647,从而构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库。使用兔抗长角血蜱全蜱血清对该文库进行免疫学筛选,经过2次筛选得到的阳性噬菌体转化E. coli BM25.8亚克隆为重组质粒,转化E. coli JM109,提取重组质粒进行PCR和测序分析。 结果 长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的基础库容量为1.8×106 pfu,重组率为100%,扩增后的滴度为2.4×109 pfu/ml。筛选获得42个阳性克隆,序列分析表明有12个新cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱原肌凝蛋白、环状扇头蜱幼蜱未知蛋白、黑腹果蝇染色体2R、褐黄血蜱线粒体DNA、青海血蜱HqL09、Hq05和肌球蛋白轻链mRNA等具有同源性。 结论 构建了长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,获得的阳性克隆为长角血蜱功能性抗原的研究奠定基础。     

疟疾传播媒介斑须按蚊唾液腺cDNA表达基因库的构建及原基因的筛选

目的为寻找编码按蚊唾液腺分泌性蛋白质的基因.方法应用RNeasy试剂盒提取斑须按蚊唾液腺总RNA;OrientExpressTMOligo(dT)cDNALibraryConstruction系统反转录合成双链cDNA,修饰后加上EcoRⅠ/HindⅢlinker,经酶切、大小分馏后,与λSCREEN-1臂相连,体外包装为λ噬菌体颗粒,构建成cDNA表达文库;在感染大肠杆菌ER1647后,检测cDNA表达文库的大小;应用兔抗唾液腺蛋白血清对部分文库进行免疫筛选,并将含cDNA片段的阳性λSCREEN克隆株转化成pSCREEN质粒,经EcoRⅠ/HindⅢ消化后,分析cDNA片段.结果cDNA表达文库容量为4×106/pfu.应用抗唾液腺蛋白血清筛选,获得3个阳性克隆株,酶切后cDNA片段的长度约为500pb.结论已筛选到与抗唾液腺蛋白的免疫血清反应的阳性克隆株,而且获得编码唾液腺蛋白抗原的基因片段,并将其转入pSCREEN质粒中,为进一步研究蚊唾液腺内编码分泌性蛋白质基因的作用奠定了基础.     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

SMART技术构建人肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库

目的:构建肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库.方法:从肝癌细胞提取总RNA,纯化mRNA.用逆转录酶链式反应(RT-PCR)反转录合成cDNA第1链,LD-PCR合成cDNA第2链,除去<500 bp小片段,与λTripLEx2噬菌体载体连接并体外包装,转化大肠感菌E.coli XL1-blue,测定文库的库容和重组率,PCR鉴定插入cDNA片段大小.结果:构建的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,原始库容为3.4×10~6pfu/mL,重组率为98.2%;文库扩增后库容为9.6×10~8 pfu/mL,重组率为97.2%.重组子插入cDNA片段大小0.6-2(平均1.4)kb.结论:成功构建高质量的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,为肝癌特异性抗原的筛选和鉴定奠定了基础.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.