自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响

目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L).RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响;MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响.结果 低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P＜0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P＜0.05).结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化.     

氧化苦参碱抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化及其机制研究

 目的：探讨氧化苦参碱(OM)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK52E细胞,随机分为：对照组、高糖组、高糖+OM不同浓度组和高糖+0.50 g/L OM动态观察组。采用real-time PCR和Western blotting方法检测转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果：（1）与对照组相比,高糖组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均进行性增高,Smad7蛋白表达进行性降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低,呈时间依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达进行性增高（P＜0.05）;（2）与高糖组相比,高糖+ OM不同浓度组随OM剂量增加,TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达均逐渐降低,Smad7蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且呈剂量依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异;（3）与高糖组相比,高糖+0.50 g/L OM动态观察组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达持续降低,Smad7蛋白表达持续增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达持续增高（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异。结论：OM可抑制高糖诱导的NRK52E细胞发生EMT,其机制可能与OM下调TGF-β1表达及上调Smad7蛋白表达,进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应有关。     

Nrf2对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞中IKKs表达的影响

目的:探讨香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激后人支气管上皮细胞中核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的表达与IκB激酶家族(I kappa B kinases,IKKs)的关系。方法:培养人支气管上皮细胞,分为正常对照(control)组、CSE组、15-脱氧-前列腺素J2(15-deoxy-prostaglandin J2,15dPGJ2)预处理后CSE刺激(15d-PGJ2+CSE)组和Nrf2 siRNA转染后CSE刺激(Nrf2 siRNA+CSE)组。首先通过CSE刺激人支气管上皮细胞,再通过15d-PGJ2预处理和Nrf2 siRNA转染的方法来增加和降低Nrf2的水平,并用RT-PCR法及Western blot法观察各组细胞Nrf2与IKKs的表达。结果:支气管上皮细胞在CSE的刺激下,Nrf2和IKKα/β的mRNA表达水平均明显升高,蛋白表达水平亦明显增高(P0.05)。在支气管上皮细胞中,15d-PGJ2预处理可增加Nrf2的表达,而Nrf2 siRNA可成功抑制Nrf2的表达。Nrf2表达增加伴有IKKα/β表达明显降低;而Nrf2表达被抑制后,IKKα/β表达明显增加(P0.05)。这些变化在转录水平和翻译水平是一致的。结论:Nrf2能抑制CSE诱导的人支气管上皮细胞中IKKs的表达。     

缺氧在肝星状细胞激活中的作用机制

目的:探讨缺氧在肝星状细胞(HSC)激活中的作用机制.方法:缺氧培养大鼠HSC株HSC-T6,逆转录PCR检测HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA的表达,Westren blot检测α-SMA表达.缺氧/常氧下,加TGF-β1中和抗体、HIF-1α诱导剂氯化钴(CoCl2)或抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2),逆转录PCR检测HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA的变化.结果:缺氧能诱导HSC-T6表达HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA及α-SMA蛋白;常氧下CoCl2能诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mR-NA,TGF-β1中和抗体及2ME2能减弱缺氧诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA,但表达量仍高于常氧培养.结论:缺氧能激活HSC,分泌Ⅰ型胶原,增加细胞外基质沉积,其作用机制既依赖于TGF-β的胞内信号传导机制,也与HIF-α介导的信号传导有关,在肝纤维化形成中起着举足轻重的作用.     

白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响

 目的: 研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4 )的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法: 体外培养HSC-LX2,随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+ plumbagin (2 μmol/L、1.5 μmol/L及1 μmol/L)组;细胞与各药物共同孵育72 h后,采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达;原位装载探针法测定细胞内ROS的水平;Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果: 与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,2 μmol/L和1.5 μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),下调ROS水平,降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论: Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。     

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响*

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因（xeroderma pigmentosum group D, XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2（mitotic arrest deficient 2, MAD2）表达的变化及对细胞增殖的影响。方法：将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组（空白对照组）、脂质体转染HepG2细胞组（脂质体组）、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组（N2 组）和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组（XPD组）。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果：与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Rb mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低（P<0.05）。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论：XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。     

罗格列酮预处理对凝血酶激活的小胶质细胞PPARγ、Nrf2及HO-1表达的影响

 目的: 采用凝血酶激活新生大鼠神经胶质细胞,观察罗格列酮预处理对小胶质细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、核因子E2相关因子2(Nrf-2)及血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响。方法: 用新生SD大鼠的脑组织,体外培养原代小胶质细胞14 d左右分离收集细胞,分为:正常对照组、凝血酶刺激组、罗格列酮干预组(罗格列酮+凝血酶组)和维甲酸干预组(维甲酸+凝血酶组)进行实验。分别采用免疫组化染色、real-time PCR和Western blot检测PPARγ、Nrf2和HO-1的表达并进行统计分析。结果: 免疫组化染色显示,与对照组比较,刺激组、罗格列酮+凝血酶组及维甲酸+凝血酶组的PPARγ、Nrf2和HO-1染色细胞数均增多。Real-time PCR结果显示罗格列酮+凝血酶组PPARγ、Nrf2及HO-1的mRNA表达均显著高于刺激组、对照组及维甲酸+凝血酶组(P<0.01),维甲酸+凝血酶组Nrf2及HO-1的mRNA表达均较刺激组和罗格列酮+凝血酶组降低(P<0.01)。Western blot结果显示,罗格列酮+凝血酶组PPARγ、Nrf2及HO-1的蛋白表达也明显高于刺激组、对照组及维甲酸+凝血酶组(P<0.01),维甲酸+凝血酶组Nrf2及HO-1的蛋白表达均较刺激组和罗格列酮+凝血酶组降低(P<0.01)。结论: 罗格列酮预处理后可增加凝血酶激活的小胶质细胞PPARγ、Nrf2及HO-1的表达,通过维甲酸预处理抑制Nrf2的表达后,其下游基因HO-1表达也受影响,说明PPARγ抗氧化作用可能是通过Nrf2调控下游基因实现的。     

聚肌胞苷酸刺激的上皮细胞对成纤维细胞活化的影响及EMMPRIN的作用

 目的：探讨聚肌胞苷酸［poly(I:C)］作用上皮细胞后对气道成纤维细胞增殖和转分化的影响及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的作用。方法：以poly(I:C)作用于人肺泡上皮细胞,将细胞上清刺激人气道成纤维细胞或种植在胶原凝胶中的成纤维细胞,观察后者增殖、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和EMMPRIN表达及凝胶收缩;以EMMPRIN刺激成纤维细胞,检测细胞增殖、α-SMA表达及MMP-2、-9活性水平;应用p38 MAPK和ERK1/2抑制剂,观察对α-SMA表达及EMMPRIN分泌的影响。结果：Poly(I:C)作用的上皮细胞上清诱导成纤维细胞增殖、α-SMA和EMMPRIN表达及凝胶收缩;EMMPRIN剂量依赖性增强细胞增殖、α-SMA表达及MMP-2、-9活性;poly(I:C)作用的上皮细胞上清激活成纤维细胞p38 MAPK和ERK1/2信号通路,两者特异性阻断剂减弱成纤维细胞α-SMA和EMMPRIN表达。结论：Poly(I:C)作用上皮细胞后诱导成纤维细胞增殖、α-SMA表达和凝胶收缩,p38 MAPK和ERK1/2信号通路介导了上述过程,EMMPRIN是其中重要介质。     

PLGF参与Ang II诱导的心脏成纤维细胞激活

 目的：探讨胎盘生长因子（PLGF）在血管紧张素II（Ang II）激活心脏成纤维细胞(CFs)中的表达及其作用。方法：原代分离培养并鉴定新生SD大鼠CFs。蛋白免疫印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、PLGF和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2),免疫荧光观察α-SMA的表达,WST-1法检测细胞增殖,RT-PCR检测PLGF、I型和III型胶原蛋白的mRNA表达水平。结果：(1)Ang II组PLGF mRNA 表达明显高于对照组（P<0．01),联用替米沙坦后,PLGF mRNA表达水平下降;Ang  II组PLGF蛋白表达水平高于对照组（P<0.05); (2)PLGF诱导CFs增殖及α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）;PLGF干预CFs 60 min后,p-ERK1/2蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.01);(3)Ang II+anti-PLGF组与Ang II组比较,细胞增殖和α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,I型和III型胶原蛋白mRNA表达水平亦下调（P<0.05）。结论：PLGF可能参与Ang II诱导的CFs增殖和纤维化过程。     

巨噬细胞移动抑制因子经Rho激酶途径促进人胚肺成纤维细胞表型转化

 目的：观察重组巨噬细胞移动抑制因子（rMIF）对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）表型转换的作用,探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法：不同浓度的rMIF (25~100 μg/L)分别作用于MRC-5细胞24 h或48 h,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）  mRNA表达,Western blotting检测α-SMA蛋白合成;100 μg/L rMIF刺激MRC-5细胞48 h,刺激前0.5 h加入Rho拮抗剂Y27632,RT-PCR法检测α-SMA mRNA表达,Western blotting法检测α-SMA表达;100 μg/L rMIF分别刺激MRC-5 6 h、12 h、24 h或48 h,Western blotting检测磷酸化肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（p-MYP1）蛋白合成。结果：刺激MRC-5 24 h,不同浓度的rMIF对α-SMA mRNA转录未见显著影响（P>0.05）。刺激MRC-5细胞48 h,rMIF可呈剂量依赖地促进α-SMA mRNA （r=0.697,P<0.01）和蛋白（r=0.957,P<0.01）表达。Y27632预刺激后,显著抑制rMIF100 μg/L促进α-SMA mRNA和蛋白表达的作用（均P<0.01）。rMIF刺激6 h后,p-MYPT1表达显著增加（P<0.01）,12 h达到高峰（P<0.01）,24 h开始下降,但24 h和48 h其水平仍高于对照组（均P<0.01）。结论：rMIF通过Rho信号通路刺激成纤维细胞表型转化,可能在哮喘气道重塑的发病机制中发挥关键作用。     

芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

背景：研究发现,芒柄花素具有抗氧化、抗炎和免疫调节等生物活性。然而,芒柄花素是否具有调节葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的作用尚不明确。目的：探究芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞HSC-T6氧化应激的作用及可能的机制。方法：实验分为对照组,模型组,芒柄花素低、中、高剂量组和姜黄素组。对照组不做任何处理,模型组用葡萄糖氧化酶处理2 h,芒柄花素组和姜黄素组先用不同浓度的芒柄花素或姜黄素处理HSC-T6细胞24 h,再用葡萄糖氧化酶处理2 h。采用CCK8法检测芒柄花素对HSC-T6细胞活力的影响;化学试剂盒检测各组细胞中超氧化物歧化酶和丙二醛水平;DCFH-DA荧光探针检测各组细胞中活性氧表达;ELISA检测各组细胞培养上清液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平;免疫细胞荧光染色观察各组细胞中Ⅰ型胶原表达;Western blot检测各组细胞中Ⅰ型胶原、NOX4和Nrf2蛋白表达。结果与结论：(1)与模型组比较,芒柄花素能抑制HSC-T6细胞的活化增殖(P <0.05);(2)与对照组比较,模型组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活性和Nrf2蛋白表达均明显减低(P &...     

青蒿琥酯通过抑制ERK1/2蛋白活化负性调控HSC-T6细胞cyclin D1的表达和AP-1活性

目的: 通过观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的影响,探讨Art抗肝纤维化的分子机制。方法: 用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导HSC-T6细胞的增殖。实验分为对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Art组(Art终浓度6.25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+ERK抑制剂PD98059组。ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量,RT-PCR检测各组ERK1/2和cyclin D1 mRNA水平变化,Western blotting法检测各组p-ERK1/2和cyclin D1蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测AP-1的活性。结果: (1)PDGF-BB 可明显促进HSC-T6细胞的增殖,PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059均可抑制HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量(P<0.05,P<0.01)。(2)PDGF-BB+Art组(50 mg/L)ERK1/2 mRNA的表达低于PDGF-BB组(P<0.05),其中PDGF-BB+PD98059组ERK1/2 mRNA的表达最低(P<0.01);PDGF-BB+Art组(25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+PD98059组cyclin D1 mRNA的表达明显低于PDGF-BB组(P<0.05,P<0.01)。(3)p-ERK1/2、cyclin D1蛋白表达水平在PDGF-BB组最高,而PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059组降低(P<0.05,P<0.01)。(4)Art可使AP-1与DNA结合活性下降。结论: Art可抑制HSC-T6细胞增殖,其机制可能与其抑制ERK1/2蛋白活化从而降低AP-1的活性和下调cyclin D1的表达有关。     

FAK基因的RNA干扰对肝星状细胞生物活性的影响

目的 探讨靶向黏着斑激酶（FAK）基因的短发卡状RNA（shRNA）对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化与增殖的影响。方法 分别设计2对有小发卡结构的DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组质粒载体,经阳离子聚合物介导转染HSC-T6细胞。通过real-time PCR与Western blot进行筛选鉴定,改良MTT法观察细胞增殖,Western blot检测HSC活化的标志物α-SMA的表达。结果 shRNA1、shRNA2均能抑制FAK mRNA和蛋白表达（P＜0.05）,其中shRNA2对FAK基因抑制率达76.82%,且可明显抑制HSC-T6细胞α-SMA的表达及细胞增殖。结论 靶向FAK基因的shRNA可以抑制HSC-T6细胞的活化与增殖。     

肝复康对PDGF介导的肝星状细胞信号转导的分子机制

目的：通过观察中药肝复康含药血清对肝星状细胞（HSC-T6）细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA基因表达的影响。探讨其抗纤维化的作用机制。方法: 常规方法制备肝复康含药血清，并用不同浓度肝复康含药血清干预HSC-T6细胞株，以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察分析Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达的变化。以Western blotting检测ERK蛋白在不同干预情况下的表达。结果: 经肝复康含药血清处理，可下调HSC-T6细胞株Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达以及ERK蛋白表达水平，不同浓度含药血清作用强度也有所不同。结论: 中药肝复康对肝纤维化具有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过非特异性干扰PDGF功能，抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA的转录，以达到抗纤维化的作用。     

BMP-7对高糖环境下肾小管上皮细胞Id2和E2A蛋白表达的影响

 目的: 通过观察高糖环境下给予外源性骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对肾小管上皮细胞(NRK-52E)表达分化抑制因子2(Id2)和转录因子E2A的影响,探讨BMP-7减轻高糖诱导的肾小管纤维化病变的可能机制。方法: 将体外培养的肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:对照(control)组、高糖(HG)组和不同浓度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干预组,HG组和干预组分别设12 h、24 h和48 h 3个时点。Western blot方法检测Id2、E2A、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的表达,real-time PCR方法检测Id2 mRNA的表达。结果: 与control组相比,HG组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明显下调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明显上调(P < 0.05);与HG组相比,20 μg/L BMP-7干预组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均较同时点显著上调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平显著下调(P < 0.05)。相关性分析结果显示,Id2蛋白与E2A蛋白表达呈显著负相关(P < 0.05)。结论: BMP-7可阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞的纤维化,其机制可能与促进Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表达有关。     

全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞增殖及α-SMA表达的影响

目的: 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚肺成纤维细胞(HFL-I)增殖与分化的影响。方法: 体外培养HFL-I, MTT法检测不同浓度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d对HFL-I增殖能力的影响。5 μg/L 转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA表达,刺激0 d、1 d、3 d、5 d后,Western blotting法检测α-SMA蛋白表达。不同浓度ATRA干预,24 h后RT-PCR方法检测α-SMA mRNA表达,3 d后用Western blotting方法检测α-SMA蛋白表达。结果: (1) MTT法检测显示不同浓度ATRA以浓度依赖性方式抑制HFL-I细胞的增殖(P<0.05)。(2)5 μg/L TGF-β₁诱导后,HFL-I细胞中α-SMA mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。(3) ATRA以浓度依赖性方式下调TGF-β₁诱导的α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论: ATRA能够抑制HFL-I细胞的增殖和TGF-β₁诱导的分化,该作用可能是通过下调α-SMA mRNA和蛋白的表达实现的。     

剪切修复基因XPD抑制Ox-LDL诱导人脐动脉平滑肌细胞的增殖

目的:探讨剪切修复基因——着色性干皮病D组基因(XPD)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制。方法:将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs),实验分为空白对照组、空载质粒pEGFP-N2组、重组质粒pEGFP-N2/XPD组、Ox-LDL组、Ox-LDL+pEGFP-N2组和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组。用MTT法和Ed U法测定各组细胞的增殖率;流式细胞术检测各组细胞周期分布;利用Western blot法检测XPD、caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:Western blot实验结果发现,与空白对照组相比,pEGFP-N2/XPD组的XPD表达增加(P0.05),表明转染成功;MTT和Ed U检测结果显示,pEGFP-N2/XPD组的细胞增殖率较空白对照组降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组细胞增殖明显被抑制(P0.05)。流式细胞术的检测结果显示,与空白对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例明显减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05)。结论:XPD能抑制HUASMCs的增殖并促其凋亡,还能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点。     

TGF-β1诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及上皮间质转换

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)活化及上皮间质转换(EMT)中的作用。方法体外培养HSC-T6,用MTT法筛选TGF-β1对HSC-T6作用的最佳浓度;用10μg/L TGF-β1处理HSC-T6 24 h,相差倒置显微镜下观察细胞形态改变,免疫荧光染色法检测细胞骨架结构F-actin蛋白的表达,RT-q PCR法检测肌动蛋白α-SMA及代表上皮间质转换的神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和上皮黏附素(E-cadherin)基因表达;用不同浓度(0、5和10μg/L)的TGF-β1处理HSC-T6 24 h,Western blot检测α-SMA、N-cadherin、vimentin和E-cadherin蛋白表达。结果 10μg/L TGF-β1干预HSC-T6 24 h有最好的细胞存活率;TGF-β1刺激HSC-T6后,细胞拉伸,伪足增多呈星形,细胞间连接疏松,呈显著活化状态;F-actin聚集形成应力纤维丝,沿细胞长轴分布;实验组α-SMA mRNA及vimentin mRNA的表达量明显高于对照组(P0.05),而E-cadherin mRNA的表达量明显降低(P0.05);在不同浓度的TGF-β1呈剂量依赖性致α-SMA及N-cadherin和vimentin的蛋白表达量增多,而E-cadherin的蛋白表达量减少。结论 TGF-β1可诱导HSC-T6活化及上皮间质转换。     

氯喹对体外活化肝星状细胞自噬与胶原代谢的影响

目的:研究不同浓度的自噬抑制剂氯喹(CQ)对活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响及可能机制。方法:应用转化生长因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6细胞,给予CQ干预24 h。实验分组为:control组、TGF-β1组、TGF-β1+CQ(15μmol/L)组、TGF-β1+CQ(30μmol/L)组和TGF-β1+CQ(60μmol/L)组。采用Western blot技术检测微管相关蛋白轻链3(LC3)比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表达情况;免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;RT-q PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA的表达变化。结果:CQ干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高且呈剂量依赖性;P62蛋白表达TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组(P0.01)。TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较control组显著增加,TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。α-SMA的表达在TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于control组(P0.05),而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著差异。MMP-13表达在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降(P0.05);TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著升高(P0.05),且呈剂量依赖性。结论:自噬抑制剂CQ能显著增加HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性,这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达并抑制MMP-13表达有关。     

香烟烟雾提取物通过蛋白激酶C-核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1表达

 目的：探讨蛋白激酶C（PKC）-红系衍生的核因子相关因子2 (Nrf2)对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1（HO-1）表达的影响。方法：通过CSE刺激雄性SD大鼠气道上皮细胞,使用PKC抑制剂RO318220和Nrf2 siRNA,将细胞分为对照组、CSE 3 h组、RO318220组、Nrf2 siRNA组和RO318220+Nrf2 siRNA组,用Western blotting法分别检测HO-1、Nrf2和p-PKC蛋白表达,免疫细胞化学法观察HO-1蛋白表达,逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HO-1 mRNA表达,免疫荧光法检测Nrf2蛋白定位,测定HO-1活性。结果：暴露CSE 3 h后,Nrf2蛋白主要表达在胞核, 胞核蛋白表达增强,p-PKC蛋白、HO-1的mRNA和蛋白高表达,HO-1活性增强。预先给予RO318220,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1的mRNA和蛋白表达均明显减弱,HO-1活性显著降低。预先用siRNA沉默Nrf2,胞浆和胞核的 Nrf2蛋白表达均减弱,HO-1活性、mRNA和蛋白水平明显降低。RO318220联合Nrf2 siRNA处理后,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1 mRNA和蛋白表达均明显降低,HO-1活性明显降低。结论：CSE通过PKC激活Nrf2,诱导Nrf2核转位,从而上调HO-1的表达水平。