人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的制备抗人OX40单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法 PCR扩增人OX40胞外区的基因序列,将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达OX40胞外区蛋白,经Ni柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,通过ELISA和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Western blot和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。结果成功构建人OX40原核表达质粒pET-32a(+)-OX40,并在BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定、Ni柱纯化、透析后获得OX40胞外区蛋白;以此纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论克隆表达并纯化了人OX40蛋白,成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了实验基础。     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制和生物学活性鉴定

目的 研制鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体,并对其生物学活性进行鉴定.方法 以前期原核表达的人硫氧还原蛋白-（PD-L1）融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,Western-Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,竞争抑制法ELISA实验鉴定抗体的特异性亲和力,小鼠腹水法作大量抗体制备.结果 获得4株能够稳定分泌特异性抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞,经验证所分泌的抗体具有较强的特异性亲和力,经过大量抗体制备和纯化获得效价大于1∶32000的纯化抗体;同时获得1株能稳定分泌抗硫氧还原蛋白抗体的杂交瘤.结论 成功制备了鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的 表达纯化人博卡病毒( human Bocavirus,HBoV) VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoV VP2蛋白的单克隆抗体.方法 应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定.结果 表达并纯化获得了重组HBoV VP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1∶4×105.结论 利用HBoV VP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价.本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础.     

FcεRⅠ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基，并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεRⅠα蛋白基因，经T-A克隆、亚克隆至pET28a（＋）原核表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL．21．STAR（DE3），IPTG诱导表达FeaRIOt亚基蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白；并用其免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗FeaRIOt亚基单克隆抗体，用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因，且测序正确；构建原核表达质粒FcεRⅠα-pET28a（＋）；成功建立4株稳定分泌抗FcεRⅠα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为G101、C22、G113、G42。通过细胞免疫荧光实验证实，4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基。结论成功利用基因重组技术制备了FcεRⅠα亚基蛋白，制备了4株效价高、特异性好的抗FcεRⅠα亚基单克隆抗体，为FcεRⅠα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础。     

人HSPC011蛋白表达纯化和单克隆抗体制备

目的表达纯化人造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)相关基因HSPC011,并制备其单克隆抗体.方法构建HSPC011原核表达载体,转化至E. coli诱导表达;Ni2+-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化HSPC011蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体;Western blot法鉴定其特异性;以所得特异性抗体为一抗,使用免疫组化法检测人毛囊毛乳头细胞中HSPC011的表达.结果成功构建了高效原核表达载体pET28a/HSPC011;经IPTG诱导在E.coli中表达了相对分子量约为13 000的目的蛋白;表达产物经纯化后纯度大于90%;获得1株抗HSPC011杂交瘤细胞;Western blot检测多种人体组织样本均在相对分子量约13 000处有一特异性条带;免疫组化检测在毛乳头细胞胞浆中可见阳性着色.结论成功表达纯化了人HSPC011蛋白并制备了其单克隆抗体,为进一步研究HSPC011基因在毛囊周期性生长调控中的具体作用,寻找有临床应用价值的毛囊活性蛋白奠定了基础.     

葡萄胎病理相关基因F10编码蛋白单克隆抗体的制备与应用

目的 构建原核质粒表达葡萄胎相关新基因F10重组蛋白,分离纯化制备其单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法用逆转录聚合酶链反应法从成人组织中扩增F10编码序列,将其克隆到p ET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达F10基因重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌F10单克隆抗体的效价和类型,免疫组织化学染色检测F10蛋白在葡萄胎及胎盘组织中的表达,鉴定制备F10单克隆抗体的特异性。结果 成功构建了p ET28a/F10原核表达质粒并获得高纯度的重组F10蛋白。筛选出3株能稳定分泌抗F10蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶7.2×105,免疫球蛋白类型均为Ig G1类。免疫组织化学染色显示该抗体能特异结合葡萄胎及胎盘绒毛组织中的F10蛋白,且葡萄胎组织中F10蛋白的表达显著高于正常胎盘组织。结论 表达及纯化的重组F10蛋白纯度高,免疫原性强。以此为抗原制备的抗F10蛋白的单克隆抗体效价高、特异性强,可用于F10功能的进一步研究。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备

目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的表达纯化人博卡病毒（human Bocavirus,HBoV）VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoVVP2蛋白的单克隆抗体。方法应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定。结果表达并纯化获得了重组HBoVVP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1：4×10^5。结论利用HBoVVP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价。本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础。     

小鼠抗人亲环蛋白A(CypA)单克隆抗体的制备和应用

目的原核表达人亲环蛋白A (CypA)、制备抗人亲环蛋白A (CypA)单克隆抗体(mAb)并初步探索其在结肠癌发生发展中的作用。方法根据CypA基因序列,以原核表达系统表达CypA重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,免疫小鼠,杂交瘤法制备mAb;采用免疫组织化学染色法检测CypA在结直肠癌与癌旁组织中的差异表达,并分析与临床病理参数的相关性。结果成功构建了CypA原核表达载体,获得纯化的目的蛋白;获得1株稳定分泌抗人CypA mAb的杂交瘤细胞株;研究表明,结直肠癌组织CypA阳性染色率显著增高并与肿瘤分化程度及淋巴结转移相关。结论成功制备了小鼠抗人CypA mAb,并发现CypA在结直肠癌组织中高表达,与低分化和淋巴结转移呈正相关。     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备

目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了ERCC1蛋白.SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37 000.获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株(6F8), 其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶ 1.5×106.Western blot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性.结论:成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb.     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

MBP-CsgAⅢ融合蛋白的表达和纯化

目的 构建CsgA亚单位蛋白的原核表达系统，获得纯化的MBP-CsgAⅢ融合蛋白，为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定基础。方法 用PCR的方法从大肠杆菌野生株MC4100株中扩增出csgA基因，连接到pMAL-p2质粒上，构建pZB-aⅢ重组质粒。将重组质粒转入XL1-Blue菌中用IPTG，用Amylose Resin纯化系统纯化。结果 成功构建了MBP-CsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统，获得大量纯化的MBP-CsgAⅢ融合蛋白。结论 成功构建了MBP-CsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统，应用该系统能有效表达MBP-CsgAⅢ融合蛋白，为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定了基础。     

抗淋巴样增强因子-1羧基端单克隆抗体的制备及其表位的初步鉴定

目的 制备抗淋巴样增强因子-1(LEV-1)羧基端86个氨基酸(Lct86)特异性单克隆抗体,并初步明确其表位,为进一步研究LEF-1 C端特异序列的功能奠定基础.方法 从Jurkat细胞株中扩增LEF-1 C端特异序列eDNA,并克隆入PQE40、pET32a原核表达载体;分别转化入M15、BL21(DE3)感受态菌,IPIG诱导表达;纯化PQFAO-Lct86融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体,以pET32a-Lct86融合蛋白鉴定单克隆抗体特异性.LEF-1 C端特异序列不同长度的基因片段定向克隆人PQE40,鉴定各片段的表达,利用Western blotting初步鉴定单克隆抗体的表位.结果 成功构建了PQE40-Lct86、pET32a-Lct86重组原核表达载体;纯化获得PQE40-Lct86融合蛋白;得到一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,证实其表位位于437aa～454aa.结论 成功制备了一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,并鉴定其抗原识别表位位于437aa～454aa,为进一步研究LEF-1 C端的功能奠定基础.     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。     

抗人RKIP单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗人RKIP（hRKIP）的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：自行构建表达人RKIP重组蛋白（reRKIP）,纯化的reRKIP免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用免疫荧光和Western blot鉴定mAb的特异性。结果：成功构建RKIP原核表达载体,转化BL21后可高效表达reRKIP,成功地获得4株（EC1,ED2,ED5和8B3）分泌抗人reRKIP mAb的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞培养上清分泌的mAb在免疫荧光和Westernblot试验中均可与细胞中RKIP蛋白反应。结论：成功地制备了4株抗hRKIP mAb,为进一步研究RKIP生物学功能奠定了基础。     

反转录病毒介导基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景：间充质干细胞成骨分化早期是成骨性细胞外基质细胞外间质的堆积,其主要成分均是基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1(tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1,TIMP-1)作用的基质金属蛋白酶作用底物,通过增加TIMP-1的表达,是否可以抑制基质金属蛋白酶的活性,进而影响间充质干细胞的成骨分化能力？ 目的：观察反转录病毒介导TIMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力。 方法：设计In-Fusion引物扩增TIMP-1基因片段,与酶切后线性化的pBABE-Puro反转录病毒表达载体进行位点同源重组,构建TIMP-1基因反转录病毒表达载体,RT-PCR和测序验证,并使用GP-293细胞进行包装。通过密度梯度法分离人下颌骨来源骨髓间充质干细胞,流式细胞仪验证其表面标记。将TIMP-1反转录病毒包装液感染骨髓间充质干细胞并筛选稳定表达TIMP-1细胞株,RT-PCR和蛋白电泳验证其表达,并使用成骨诱导液诱导10 d,观察其对成骨能力的影响,RT-PCR验证其成骨相关基因的表达。 结果与结论：经测序证实,RT-PCR所获得的TIMP-1基因 cDNA 序列与NM_003254.2(624 bp)序列完全一致;通过表面标记鉴定证实成功分离了人骨髓间充质干细胞,并具良好的成骨、成脂能力;RT-PCR和Western Blot验证反转录病毒载体成功介导TIMP-1转染骨髓间充质干细胞,RT-PCR表明成骨诱导10 d时,TIMP-1基因感染组成骨增加,RUNX-2和COL1 mRNA表达增加。提示TIMP-1基因可通过反转录病毒成功转染人骨髓间充质干细胞,并能促进其成骨。