NK细胞对不同人肝癌细胞株的杀伤作用

目的: 观察自然杀伤(NK)细胞对不同肝癌细胞株的体内外抑瘤作用,并检测肝癌细胞MHC-I类链相关蛋白(MIC蛋白)的表达。方法: 抽取志愿者外周血50 mL,分离单个核细胞,置入NK细胞试剂盒行孵化及逐级扩增。计算NK细胞对人白血病细胞株K562及人肝癌细胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721的杀伤率。接种建立人肝癌细胞株裸鼠移植瘤,进行NK细胞瘤内及瘤周注射;计算各组裸鼠移植瘤的体积,绘制各组肿瘤生长曲线;处死裸鼠,称瘤重,计算NK细胞对各组肿瘤抑制率。检测人肝癌细胞表面 MIC蛋白表达。结果: NK细胞对K562细胞杀伤最强,BEL-7402次之,SMMC-7721细胞株杀伤敏感性最低。裸鼠抑瘤实验结果显示NK细胞对于BEL-7402细胞株的抑瘤效果最好,而对于SMMC-7721细胞株的抑瘤效果较差。BEL-7402及HepG2细胞株表面表达MIC,而SMMC-7721则很少表达。结论: NK细胞对于不同人肝癌细胞株体内外抑瘤作用不同,其差异可能和不同肝癌细胞株MIC的表达有关。     

三氧化二砷对肝癌细胞生长抑制作用差异性探讨

目的:观察三氧化二砷对肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞生长抑制作用差异性并且探讨其可能的作用机理。方法: 应用细胞培养和台盼蓝拒染法观察不同时间和不同浓度的三氧化二砷对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402细胞生长的抑制作用,比较生长抑制率的差异并用谷胱甘肽检测试剂盒测定两种肝癌细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。结果: 三氧化二砷浓度为0.50 μmol/L、作用时间为24 h可显著抑制肝癌细胞系BEL-7402的生长,抑制作用呈时间、剂量依赖性;对SMMC-7721细胞,三氧化二砷浓度为2.00 μmol/L、作用时间为24 h才出现抑制细胞生长作用,二者的生长抑制率存在显著差异,0.25-2.00 μmol/L As₂O₃作用72 h后,BEL-7402细胞的生长抑制率均高于SMMC-7721细胞(P＜0.05)。检测SMMC-7721和BEL-7402细胞内GSH含量分别为(50.8±5.2)μmol/g protein和(18.7±1.4)μmol/g protein,存在明显差异。 结论:三氧化二砷抑制肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402的生长存在显著的差异;BEL-7402细胞对三氧化二砷非常敏感性,可能与其细胞内谷胱甘肽含量较低,细胞的氧化还原解毒系统不足有关。     

乙酰肝素酶反义硫代寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞系侵袭力的抑制作用

目的探讨乙酰肝素酶反义硫代寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞系侵袭力的抑制作用。方法设计合成互补于HPAmRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体OligofectamineTMReagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞HPAmRNA及蛋白表达的变化,以基底膜重建实验检测SMMC-7721、BEL-7402细胞侵袭力的变化。结果与正常对照组相比,AS-ODN转染组SMMC-7721、BEL-7402细胞HPAmRNA和蛋白的表达均显著下降(P<0.01,P<0.05),转染后两细胞系的侵袭力抑制率分别为55.8%和61.8%。结论HPA硫代反义寡脱氧核苷酸可通过下调HPAmRNA和蛋白的表达抑制肝癌的侵袭力。     

GRAMD4在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 检测GRAMD4在肝细胞癌中的表达情况,分析其与肝癌临床病理特征之间的相关性.方法 收集40例肝细胞癌及对应癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测GRAMD4在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况,统计学分析GRAMD4mRNA表达与肝癌临床病理特征之间的相关性;应用RT-PCR技术检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞Hep3B、HepG2、SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达.结果 GRAND4 mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达显著高于对应的癌旁组织(P＜0.05);GRAMD4 mRNA的高表达与肿瘤体积增大、高Edmonson分级和高TNM分期呈明显正相关(P＜0.05);肝癌细胞株Hep3B、HepG2和SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达较正常肝细胞LO2显著增加(P＜0.05).结论 肝癌细胞系及肝癌组织中GRAMD4表达上调,且GRAMD4的表达上调与肝癌的恶性病理特征相关.     

核转录因子HMBOX1对肝癌细胞生物学特征的影响

目的:比较肝癌细胞系与肝细胞系中HMBOX1的表达水平,探讨其在肝癌发生、发展中的作用。方法:RT-PCR检测HMBOX1在多种肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达。利用分子生物学方法构建pEGFP:HMBOX1融合表达载体,采用脂质体方法转染HepG2肝癌细胞系,MTT方法及流式细胞技术评价转染后细胞增殖和细胞周期的变化。基因芯片技术分析表达载体转染HepG2后肿瘤相关信号通路的变化。结果:PCR结果显示肝癌细胞系HMBOX1 mRNA表达水平明显低于正常肝细胞系;pEGFP:HMBOX1融合表达载体转染HepG2后,细胞的增殖能力和周期未出现显著变化;基因芯片的结果提示转染表达载体的HepG2细胞,肿瘤和免疫信号通路相关基因的表达发生显著变化。结论:HMBOX1在多种肝癌细胞系表达下调,可能参与了多条与肿瘤和免疫相关信号通路的调节,为进一步阐明肝癌的发生机制提供了新的实验依据。     

MYH9在人肝癌组织中的表达及其对肝细胞系增殖和凋亡的影响

目的探讨非肌肉肌球蛋白重链(MYH9)在肝癌组织中的表达及通过沉默MYH9基因对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及凋亡的影响。方法收集50组人肝癌组织及癌旁组织,选用人肝癌细胞系SMMC-7721和Hep G2及人正常肝细胞系LO2,免疫组织化学方法及Western blot检测肝癌组织及癌旁组织中MYH9蛋白的表达,Western blot检测SMMC-7721、Hep G2及LO2中MYH9蛋白的表达;将MYH9 siRNA转染SMMC-7721,CKK8法及流式细胞术检测沉默MYH9对肝癌细胞增殖及细胞凋亡的影响。结果 MYH9蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁(P0.05);MYH9蛋白在SMMC-7721及Hep G2中的表达均明显高于LO2(P0.05);沉默MYH9基因可抑制细胞增殖(P0.001),促进细胞凋亡(P0.05)。结论 MYH9蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织;MYH9低表达能有效抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

miR-133a-3p 通过抑制氧化还原因子1 抑制肝癌细胞恶性生物学行为

目的:通过多种实验途径探讨miR-133a-3p通过调节氧化还原因子1(Ref-1)对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:收集2017年2月～2018年12月来本院就诊的肝癌手术患者的癌组织和癌旁相邻正常组织标本,用qRT-PCR检测miR-133a-3p在癌组织和癌旁相邻正常组织中以及在肝癌细胞系HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721和肝正常细胞Hep-3B中的表达;构建miR-133a-3p-mimics(miR-mimics组、miR-NC转染质粒组和正常对照组(Control),qRT-PCR检测转染前后miR-133a-3p在HepG2中的表达;CCK-8和克隆形成实验检测HepG2细胞转染前后增殖能力变化;细胞划痕和Transwell实验分别检测转染前后HepG2细胞的迁移和侵袭能力变化;RNA转录组测序检测HepG2细胞转染前后转录组RNA表达差异并作通路富集分析;qRT-PCR检测筛选RNA-seq中RNA表达差异较大的基因;qRT-PCR和Western blot检测Ref-1在HepG2细胞转染前后中的表达。免疫组化和qRT-PCR分别检测Ref-1在肝癌组织和肝癌细胞系中表达;最后HepG2细胞同时转染了miR-mimics和Ref-1 miR-inhibitors,进行联合干预,随后CCK-8、细胞划痕和Transwell分别检测了联合干预后细胞增殖、迁移和侵袭能力变化。结果:miR-133a-3p在肝癌患者癌组织中的表达显著低于癌旁组织,同时其在肝癌细胞HepG2中的表达最低;qRT-PCR结果表明miR-mimics可有效促进miR-133a-3p在HepG2中的表达;CCK-8和克隆形成实验结果显示miR-133a-3p过表达后可以显著抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为;RNA-seq结果显示HepG2转染前后Ref-1的表达差异最大;qRT-PCR和Western blot结果显示HepG2转染成功后,Ref-1表达随miR-133a-3p的过表达而降低。免疫组化和qRT-PCR结果显示Ref-1在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达均显著高于阴性对照组;联合干预后HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学抑制作用更加强烈。结论:miR-133a-3p可能通过抑制Ref-1表达从而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。     

Nrf2在不同肝癌细胞株中的表达及定位

目的:观察红系衍生的核因子2相关因子2(Nrf2)在肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)中的表达及分布情况.方法:应用流式细胞术测定Nrf2阳性细胞的比例,激光共聚焦观察Nrf2在3种细胞株中的定位情况,通过Wostern blot测定Nrf2在不同细胞胞质及胞核中的表达差异.结果:流式细胞术测定Nd2在HepG2、Hep3B和SMMC-77213种细胞中表达率分别为99.39%、99.94%和99.98%,激光共聚焦观察到Nd2在3种肝癌细胞株胞质胞核中均有分布,但不同细胞的分布规律各不相同,Western blot结果显示:Nrf2在HepG2中以胞质分布为主,在Hep3B中胞质、胞核分布相当,在SMMC-7721中以胞核分布为主.结论:Nrf2在3种肝癌细胞株(HeqG2、Hep3B、SMMC-7721)中均有表达,且在胞质胞核中均有分布,但在不同细胞中的分布规律各不相同,为下一步探讨肝癌细胞耐药机制的相关研究奠定了基础.     

鼠抗人天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体的制备与肿瘤表达检测

目的:通过制备抗天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体(mAb),检测ASNS在不同肿瘤中的表达,探索其表达的意义。方法:诱导表达融合蛋白MS2-ASNS,以纯化的MS2-ASNS蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0融合,以融合蛋白MS2-ASNS和MS2-PAI通过间接ELISA双筛和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA和Western blot方法对抗ASNS mAb效价、特异性及亲和力进行鉴定。IHC技术检测ASNS在肿瘤细胞株及肿瘤组织中的表达。结果:获得2株能高效分泌特异性抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株F4-15、F4-16,亚类均为IgG2a。间接ELISA结果表明制备的抗体有很好的特异性,抗体效价均达到1∶5×105。Western blot鉴定抗ASNS mAb能特异性识别肿瘤细胞株中的ASNS。IHC技术检测天然ASNS在胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、HepG2及肺癌、食管癌组织中均为胞质表达。结论:制备的抗ASNSmAb特异性强,可检测ASNS在多种肿瘤中的表达,为进一步研究ASNS在特定肿瘤如中线鼻/鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达奠定了基础。     

两种人体肿瘤细胞系(ECa-109、BEL-7402)和正常中国地鼠卵巢细胞系(CHO)体外浸润能力的研究

本文采用双层琼脂体外器官和实验细胞共培养的方法,将人体食管癌细胞系(ECa-109),人体肝癌细胞系(BEL-7402)和正常中国地鼠卵巢细胞系(CHO)对鸡胚中肾和心肌的浸润能力,进行了研究。结果表明:ECa-109细胞和BEL-7402细胞在体外都有浸润能力,ECa-109的浸润能力比BEL-7402强;正常CHO细胞无浸润能力,只能轻微附着靶组织;鸡胚中肾和心肌接受恶性细胞ECa-109和BEL-7402浸润的能力相同。     

抗人NRP1单克隆抗体的活性鉴定及初步应用

目的鉴定抗人神经菌毛素1(neuropilin1,NRP1)单克隆抗体的生物活性并利用该抗体检测常见肿瘤细胞株NRP1蛋白的表达情况。方法腹水法制备4株抗NRP1单克隆抗体并用rProtein A亲和柱纯化抗体,间接ELISA检测4株抗体的滴度水平,Western blot分析4株抗体结合NRP1蛋白的特异性,流式细胞术分析4株抗体结合NRP1蛋白的亲和力,共聚焦免疫荧光实验进一步验证抗体结合NRP1蛋白的能力;细胞免疫组织化学染色检测14株肿瘤细胞表达NRP1蛋白的情况。结果 4株抗体均能特异结合NRP1蛋白,其中A6结合NRP1能力最强,能结合在表达NRP1蛋白的细胞膜表面。细胞免疫组织化学染色结果显示NRP1在HepG2、C6、HEK293、BEL-7402、MDA-MB-453呈高水平表达,在U87、MGC803、MCF7、MDA-MB-231中表达水平相对较弱,而在U251、BGC823、H6、HT-29的表达介于两者之间,在SMMC-7721细胞中未检测到表达。结论 4株抗NRP1单克隆抗体均能特异结合NRP1蛋白,多种肿瘤细胞株均不同程度表达NRP1蛋白,为进一步探讨NRP1蛋白与肿瘤发生发展的关系奠定了基础。     

阻断Sonic Hedgehog信号对不同人肝癌细胞生长的影响

 目的: 研究阻断Sonic Hedgehog (Shh)信号对不同人肝癌细胞生长的影响,探讨阻断Shh信号抑制肝癌细胞生长的机制。方法: RT-PCR法检测Shh信号分子在3株人肝癌细胞(BEL-7402、Huh7和HepG2)中的表达,并检测Shh阻断抗体作用后BEL-7402细胞Shh信号效应分子表达变化;MTT法检测人肝癌细胞增殖活性;流式细胞术检测人肝癌细胞凋亡;Western blot 检测凋亡相关蛋白表达。结果: Shh信号分子在3株人肝癌细胞中均有表达,Shh阻断抗体可以下调Shh信号效应分子patched (Ptch)、Gli1和Gli2的表达;Shh阻断抗体可以抑制3株肝癌细胞生长,增加G₀/G₁期细胞,并诱导细胞凋亡;Shh阻断抗体作用后,BEL-7402细胞pro-caspase-3、pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白表达水平下降,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高。结论: 阻断Shh信号可抑制Shh高表达的人肝癌细胞生长,阻滞细胞周期于G₀/G₁期,并诱导肝癌细胞凋亡。     

用噬菌体表面展示技术筛选与肝癌细胞系结合的抗体模拟肽

目的:从噬菌体展示肽库中,筛选可与肝癌细胞特异性结合的抗体模拟肽。方法:通过生物淘选使噬菌体富集。利用ELISA法,鉴定噬菌体单克隆原种的亲和性,并进行统计学分析。通过竞争ELISA,分析筛选所得抗体模拟肽的结合位点,并进一步分析抗体模拟肽的序列组成。结果:随着淘选次数的增加,出现噬菌体的富集。ELISA的结果显示,相对于正常肝细胞,筛选所得环状7肽对肝癌细胞系SMMC7721和BEL7402均有良好的结合活性(P<0.05),且与SMMC7721细胞的结合活性明显优于与BEL7402细胞的亲和性(P<0.05)。在α=0.01的水平上,7肽单克隆噬菌体原种可明显与scFv竞争结合SMMC7721细胞(0.005相似文献   

Apigenin,a flavonoid constituent derived from P. villosa,inhibits hepatocellular carcinoma cell growth by CyclinD1/CDK4 regulation via p38 MAPK-p21 signaling

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a leading cause of cancer mortality worldwide. Apigenin was widely used in HCC treatment; however, the detailed mechanisms have not been clarified. We isolated, characterized, and identified Apigenin from the P. villosa plant using ethanol-extracted, semi-preparative HPLC and NMR. MTT was used to detect the cytotoxicity of Apigenin in HepG2, SMMC-7721 and Huh-7 cell lines. The cell cycle changes of Apigenin on HepG2 using flow cytometry and the key molecules of cell cycle regulation by RT-qPCR and Western blot. Apigenin was ethanol-extracted and semi-preparative HPLC was used for isolation and purification. The compounds were identified and the results showed Apigenin was one of the bioactive compounds. Apigenin exhibited relatively high cytotoxicity in HepG2, SMMC-7721, and Huh-7. Cell cycle analysis showed that Apigenin could induce G1 arrest in HepG2 in a dose-dependent manner. CyclinD1 was up-regulated and CDK4 was down-regulated upon Apigenin treatment, which indicated that Apigenin could block cell cycle progression at the G1 phase though the regulation of CDK4 and CyclinD1 expression. In conclusion, the present findings might provide new insights about the implication of Apigenin and P. villosa in cancer therapy.     

miR-634 在肝癌中的表达及对肝癌细胞生物学行为的影响

目的:检测microRNA-634(miR-634)在肝癌中的表达水平及其对肝癌细胞常见生物学行为的调控作用。方法:采用实时荧光定量PCR(RT鄄qPCR)法检测肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、Bel7402、Bel7404、SNU739)、69 例肝癌组织及匹配癌旁组织中miR-634 的相对定量,分析miR-634 表达与肝癌患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、门静脉癌栓及肝外转移的关系,同时构建miR-634 的真核表达载体并转染肝癌细胞系,采用活细胞计数试剂盒CCK-8、流式细胞仪Annexin V/ PI 双染法和Transwell 侵袭实验检测转染miR鄄634 对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。结果:与正常人肝细胞系L-02 相比,肝癌细胞的miR-634 水平均降低(P <0.05),表达量依次为HepG2 >SNU739 >Bel7402 > Bel7404 >SMMC7721;69 例肝癌组织的miR鄄634 水平为(0.253±0.019),低于匹配癌旁组织(P<0.05),且与肿瘤直径、分化程度、BCLC分期、门静脉癌栓及肝外转移均有关(P<0.05)。过表达组转染24 ~96 h 后的miR鄄634 水平持续升高,与对照组和空转染组的差异有统计学意义(P<0.05);与对照组和空转染组相比,转染组的增殖抑制率、凋亡率均升高,但穿膜细胞数降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-634 在肝癌组织和细胞中均为低表达,且与临床病理参数有关,上调其水平可抑制肝癌细胞增殖及侵袭并诱导凋亡,对于肝癌防治有重要借鉴价值。     

eEF1A2在原发性肝细胞癌的表达

 目的: 研究真核翻译延长因子1A2(eEF1A2)在原发性肝细胞癌(HCC)组织的表达,以及eEF1A2过表达对HCC细胞生物学行为的影响。方法: 应用real-time PCR法和免疫组化法分别检测62例HCC癌组织与配对癌旁组织、20例正常肝脏组织eEF1A2的mRNA和蛋白表达,应用real-time PCR法与Western blot法分别检测几种HCC细胞株eEF1A2的mRNA与蛋白表达。构建GV287-eEF1A2表达慢病毒感染低表达eEF1A2的HCC细胞,应用real-time PCR法和Western blot法分别检测细胞eEF1A2 的mRNA和蛋白表达;应用MTT法、DNA倍体法和real-time PCR法分别检测细胞活力、细胞周期和白蛋白mRNA的表达。结果: HCC癌组织eEF1A2的mRNA表达水平和蛋白表达阳性率明显高于配对癌旁组织与正常肝脏组织(P<0.01);eEF1A2的mRNA和蛋白在HCC细胞株SMMC-7721和BEL-7402高表达,在SK-HEP-1低表达。构建的GV287-eEF1A2表达慢病毒可感染SK-HEP-1细胞使eEF1A2过表达;与阴性对照组相比,GV287-eEF1A2组SK-HEP-1细胞的活力升高,白蛋白的mRNA表达水平降低,G₀/G₁ 期的细胞比例显著减少,而S期和G₂/M期的细胞比例显著升高。结论: eEF1A2在HCC癌组织存在异位高表达;eEF1A2可能是HCC的一种潜在癌蛋白,其过表达可增强HCC细胞的增殖能力,降低HCC细胞的分化程度,并促使细胞周期通过G₀/G₁期,进入S期和G₂/M期。